辛伐他汀对骨质疏松大鼠的防治作用

　　　　作者：于伟利，王世捷，韩俊丽，白芝兰，孙洪洪，晋瑞，刘燕，赵暹

【摘要】 　　目的 探讨他汀类药物对绝经后骨质疏松症的防治作用及其相关机制。方法 40只SD雌鼠随机分为4组：去势组(OVX组)、对照组(Sham组)及2个辛伐他汀(simvastatin， Simv)治疗组，每组10只。2个辛伐他汀治疗组分别为10、20mg/kg(S1和S2组)，每天灌胃一次。观察术后12周骨形成指标：骨钙素(BGP)和骨特异碱性磷酸酶(骨AKP)；骨吸收指标：尿呲啶醚(PYD)和脱氧呲啶醚(DPD)。用形态计量学、骨生物力学等实验技术， 观察辛伐他汀的治疗效果。结果 经辛伐他汀治疗后，S1和S2组BGP和骨AKP明显高于单纯去势组(分别为P<0.05)，同时尿PYD和DPD下降，且S2组与OVX组相比，有显著性差异(P<0.05)。与OVX组相比，S1、S2组骨小梁间距(Tb·Sp)明显降低(P<0.05)，骨小梁面积百分比(Tb·Ar)、骨小梁宽度(Tb·Th)、骨小梁数目(Tb·N)、骨生物力学均增加(P<0.05)，且S1与S2组之间无显著性差异。与OVX组相比，S1、S2组股骨、腰椎BMD明显增加(P<0.05)。结论 辛伐他汀在预防去势大鼠骨质疏松症的过程中，可能同时存在促进成骨和抑制破骨两方面的作用。

【关键词】 辛伐他汀；骨质疏松；骨形成；骨吸收

　　ABSTRACT: Objective To explore the preventive and therapeutic effects of simvastatin on postmenopausal osteoporosis and the action mechanism. Methods Totally 40 female SD rats were randomly pided into 4 groups with 10 rats in each: OVX group， sham group， and simvastatin groups (S1， S2). Simvastain was intragastrically administered at a dose of 10mg/(kg·d) (S1) and 20mg/(kg·d) (S2) once daily in OVX rats. After 12 weeks， the bone formation parameters such as bone osteocalin (BGP) and serum bone specific alkaliphosphatase (bone AKP)， as well as bone resorption indices urine pyridinolin (PYD) and deoxypyridinoline (DPD) were determined. At the same time， bone histomorphometry and BMP were measured. Results Twelve weeks after administration， BGP and bone AKP increased significantly in S1 and S2 compared with those in OVX group (P<0.05， respectively); PYD and DPD in S2 were decreased significantly compared with those in OVX group (P<0.05). Tb Sp in S1 and S2 was decreased significantly than that in OVX (P<0.05)， and Tb·Ar， Tb·Th ， Tb·N， BMP and biomechanic parameter in S1 and S2 were increased significantly than those in OVX (P<0.05)， but there was no significant difference between S1 and S2. Conclusion Simvastatin could stimulate bone formation， while at the same time it also decreases bone absorption.

　　KEY WORDS: simvastatin; osteoporosis; bone formation; bone absorption

　　目前，全世界约2亿多人患有骨质疏松症，其发病率已跃居常见病、多发病的第7位。骨质疏松症增加老年人发生骨折的危险，给社会及家庭造成严重危害。随着我国人口老龄化，骨质疏松的防治日益受到重视。近年来的研究显示治疗心血管疾病的常用药——他汀类调脂药，具有防止和延缓骨质疏松症骨折发生的作用。本实验选择去势大鼠作为骨质疏松模型，给予辛伐他汀(simvastatin， Simv)灌胃，研究辛伐他汀对去势大鼠骨质疏松的预防性治疗作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　40只3月龄SD雌性大鼠，体重(240±10)g，随机分为4组：去势组(OVX组)、对照组(Sham组)及2个辛伐他汀治疗组，每组10只。2个辛伐他汀治疗组分别为10、20mg/kg(S1和S2组)，每天灌胃1次。各组大鼠均用戊巴比妥钠(用生理盐水配制为20g/L戊巴比妥溶液，2mL/kg)腹腔内注射麻醉，腰背部双侧切口，去势组(OVX组)和治疗两组行双侧卵巢摘除术，对照组(Shma组)行开腹术则原位缝合，不摘除卵巢。治疗组大鼠于去势后第5天即开始用辛伐他汀(用生理盐水配制成辛伐他汀悬液，每次灌胃1mL)灌胃治疗，每日1次；Sham组和OVX组，从第5天起每天用等量的生理盐水灌胃。共治疗12周。各组大鼠均于术后12周处死。

　　1.2 血和骨标本的收集

　　实验12周时，各组以20g/L戊巴比妥溶液麻醉下处死动物。处死前称量体重，右心室采血，离心分离血清，-70℃冻存备用；取双后肢及胸腰椎骨，40g/L多聚甲醛固定。

　　1.3 尿标本的收集

　　各组鼠处死后立即无菌膀胱穿刺抽取尿液2mL，4℃，2000r/min离心10min，留取上清液，储存于-70℃至同一批。备做尿吡啶醚(PYD)和脱氧吡啶醚(DPD)测定。

　　1.4 骨形成和吸收指标的测定

　　骨形成的指标：血清骨特异性碱性磷酸酶(骨AKP)和骨钙素(BGP)，药盒由美国Metra Biosystems Inc提供(ELISA)，批内变异<5%，批间变异<10%。骨吸收的指标：尿吡啶醚(PYD)和脱氧吡啶醚(DPD)测定用RPHPLC法[1]。

　　1.5 骨组织形态计量学

　　股骨的石蜡切片经HE染色后应用半自动彩色图像分析系统分析测量。以关节软骨下1mm以外的松质骨区域，每张切片测量3个视野(×40)，取平均值，测量骨小梁宽度(Tb·Th)、骨小梁面积百分比(Tb·Ar)、骨小梁间距(Tb·Sp)及骨小梁数目(Tb·N)。

　　1.6 骨矿密度(BMD)测定

　　用QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪测量四肢骨与胸腰部椎体骨矿密度，变异系数≤3%。测量时，将各离体骨按一定顺序放入有机玻璃盒内，注入蒸馏水进行扫描。使用Regional high resolution QDR 4500小动物分析软件。

　　1.7 股骨生物力学测定

　　右股骨用微机控制电子万能试验机进行三点力学试验， 观察最大应力。支点跨距为20mm，加载速度为2mm/min。用函数记录仪描计载荷变形曲线。并根据载荷变形曲线得出最大载荷(Ultimate force， Fu)和弯曲刚度(bending stiffness， S)。

　　1.8 统计学处理

　　所有数据输入计算机，用SPSS10.0统计软件进行t检验和方差分析，结果以均值±标准差(±s)表示，检验水准α=0.05， P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组骨形成和骨吸收生化指标的变化

　　与OVX组相比，骨吸收指标尿PYD和DPD在S1、S2组均有所下降；但S1组与OVX组相比，无显著性差异；S2组与OVX组相比，有显著性差异(P<0.05)；S1、S2组均较Sham明显升高(P均<0.05)。骨形成指标BGP和骨AKP在S1、S2组明显高于OVX组(P<0.05，表1)。表1 各组骨吸收和骨形成生化指标的比较（略）

　　2.2 形态计量学指标的变化

　　与Sham组相比，OVX组Th·Sp明显升高(P<0.05)，而Tb·Ar、Tb·Th、Tb·N均明显下降(P<0.05)。与OVX组相比，S1、S2组Tb·Sp明显降低(P<0.05)，Tb·Ar、Tb·Th、Tb·N均增高(P<0.05)，S1与S2组之间无显著性差异。S1、S2组各项指标均未达到Sham水平(表2)。表2 骨形态计量学参数（略）

　　2.3 骨矿密度(BMD)的测定

　　与Sham组相比，OVX组股骨、腰椎BMD明显降低(P<0.01)；与OVX组相比，S1、S2组股骨、腰椎BMD明显增加(P<0.01)。S1与S2两组比较，无显著性差异，S1和S2组上述各项指标均未达到Sham组水平(P<0.05，表2)。

　　2.4 骨生物力学的变化

　　药物治疗12个月后，大鼠左股骨结构力学及材料力学的变化如表2。本实验表明，与Sham组相比，OVX组最大载荷和弯曲刚度明显降低(P<0.01)；S1和S2组与OVX组比较有显著性差异(P<0.05)；S1与S2两组比较无显著性差异，S1和S2组上述各项指标均未达到Sham组水平(P<0.05，表3)。表3 各组大鼠骨密度和骨生物力学参数的变化（略）

　　3 讨 论

本研究结果显示去势大鼠每天口服10、20mg/kg辛伐他汀，可使股骨、腰椎骨密度、各种生物力学参数和股骨的骨形态计量学各种参数都得到了一定程度的提高。这些都证明了服用辛伐他汀能有效减轻去势大鼠骨质疏松症的发生，且随着剂量的增大，其作用效果更显著。

骨质疏松症的药物治疗，按作用阶段可分为抑制骨吸收药物、促进骨形成药物和骨矿化物等。目前的治疗药物如雌激素、二磷酸盐及降钙素等多系抑制破骨细胞的吸收作用，以减少骨丢失，而对促进骨形成作用的药物则研究和应用较少。他汀类药物是胆固醇合成途径中限速酶3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的抑制剂，可通过对HMGCoA还原酶的抑制作用起到减少胆固醇合成的目的。目前，临床上广泛应用于降低胆固醇和预防心血管疾病。与此同时，他汀类药物同样具有激活成骨细胞、促进骨合成代谢作用， 并且不同浓度剂量对骨合成代谢作用也不同，这一特性为临床治疗骨质疏松骨折提供了新的思路，并成为目前研究成骨作用的一个热点。WILKIE等[2]以很小剂量0.1mg/(kg·d)西立伐他汀即可提高去卵巢大鼠密质骨的强度，且显著提高骨密度、骨形成率及骨钙素的水平。OXLUND等[3]以较高剂量(20mg/kg，每天2次)辛伐他汀干扰去卵巢大鼠3个月，通过检测骨生物力学、骨组织形态学及骨密度等指标发现辛伐他汀在促进大鼠骨形成增加密质骨骨密度的同时，抑制松质骨骨量的丢失。

他汀类药物的促成骨作用机制尚未阐明。目前，提出的可能作用机制如下：①促进BMP2表达。BMP2为成骨细胞的旁分泌自分泌因子，可诱导成骨细胞分化，体内和体外研究均发现，他汀类药物能增加BMP2的表达，对促骨形成的效果与BMP2的直接作用相似，故促进BMP2的合成是目前较为公认的他汀类药物刺激骨形成的理论。此外，他汀类药物还能抑Rho相关激酶(Rhoassociated kinase)活性，增加BMP2和骨钙素的表达[4]。②激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactived protein kinase， MAPK)途径。MAPK途径的激活能诱导成骨细胞热休克蛋白27的表达，后者具有调节细胞增生的功能，从而促进成骨细胞的骨形成[5]。③抑制蛋白质异戊二烯化(protein prenylation)和磷脂酞肌醇3激酶，上调成骨细胞血管内皮生长因子表达，诱导成骨细胞分化[6]。④上调钙周期蛋白(calcyclin)表达，提高成骨细胞增殖和碱性磷酸酶合成[7]。除了以上的直接作用外，他汀类药物可能还通过促血管形成和炎症抑制作用发挥增加骨形成的功能。本研究结果表明去势大鼠每天口服辛伐他汀，可使BGP、骨AKP等静态指标较OVX组和Sham组均有增高，骨形态计量学参数中的骨形成指标股骨、腰椎骨密度、各种生物力学参数和股骨的骨形态计量学各种参数都得到了一定程度的提高，说明用药后能使成骨细胞活跃增生，骨矿化和类骨质增多，骨量丢失相对减少。

他汀类药物在预防去势大鼠骨质疏松症的过程中，不仅存在促进成骨，而且还具有抑制破骨方面的作用。STAAL等[8]观察到西立伐他汀(cerivastatin)能抑制甲状旁腺激素所激发的破骨细胞骨吸收，通过测量HMGCoA还原酶活性，发现他汀类药物是直接抑制HMGCoA还原酶而降低骨吸收。辛伐他汀体外刺激成熟破骨细胞和大鼠颅盖骨培养体系，不仅可以促进大鼠颅盖骨的成骨活性，并且可以明显抑制破骨细胞骨吸收功能[9]。本研究显示反映骨吸收作用的指标PYD和DPD与去势组相比均下降，且S2组与去势组相比有显著性差异，表明辛伐他汀除了具有促进骨吸收的作用之外，亦有抑制骨吸收的作用，且随着辛伐他汀剂量的增大，抑制骨吸收的作用越明显。

综上所述，辛伐他汀在预防去势大鼠骨质疏松症的过程中，可能同时存在着既促进成骨又抑制破骨两方面的作用。辛伐他汀对骨代谢影响的分子水平具体作用机制尚未明确，而调节成骨细胞和破骨细胞代谢的转录因子和胞内信号传导途径均可能参与他汀类药物对骨代谢的调节。因此，进一步研究他汀类药物对骨代谢影响的具体作用途径，除可明确作用机制为临床应用提供依据外，还可以为发掘其他潜在的可用于骨质疏松治疗的药物提供一定的理论基础。

参考文献

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