作者：侯惠莲，张学斌，李旭，张冠军，王鸿雁，邓元，王敏
【摘要】 目的 探讨微血管密度(MVD)、DNA倍体、免疫表型与前列腺上皮内瘤(PIN)及其生物学特性的关系。方法 应用免疫组织化学SP法和计算机图像分析技术，对24例前列腺增生症(BPH)、23例低级别上皮内瘤(LGPIN)、26例前列腺癌(PC)伴发高级别上皮内瘤(HGPIN)的石蜡包埋标本进行CD34、34βE12、P63、P504s表达的检测，定量测定其MVD和细胞核DNA倍体。结果 不同级别的PIN中MVD和DNA平均倍体均明显高于BPH组，但明显低于PC组(P<0.01)，且随PIN级别的增高，DNA倍体的异多倍体数及MVD值随之升高(P<0.01)。DNA倍体与MVD呈正相关关系。34βEl2和P63在BPH和LGPIN腺体周围的基底细胞呈连续阳性，在HGPIN中呈断续阳性，在PC中呈阴性。P504s在HGPIN中呈灶状阳性，在PC中呈强阳性，在BPH和LGPIN中呈阴性。结论 DNA倍体、MVD与PIN密切相关，是反映其生物学特性的重要参考指标；免疫表型进一步证实PIN特别是HGPIN是PC的癌前病变。
【关键词】 前列腺上皮内瘤；前列腺癌；微血管密度；DNA倍体；免疫组织化学
ABSTRACT: Objective To study microvascular density (MVD)， DNA ploidy and immunophenotype in prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) as well as their relationship with its biological properties. Methods We studied paraffinembedded specimens from 24 cases of benign prostatic hyperplasia (BPH)， 23 cases of lowgrade prostatic intraepithelial neoplasia (LGPIN)， and 26 cases of prostatic carcinoma (PC) with highgrade prostatic intraepithelial neoplasia (HGPIN). Image analysis was used to measure the DNA average ploidy and MVD， and after that the expressions of 34βEl2， P63， P504s and CD34 were detected by immunohistochemistry SP. Results DNA ploidy and MVD in PIN were higher than those in BPH， but lower than in PC， and correlation was detected among different grades of PIN. MVD had a positive correlation with DNA aneuploidy in different grades of PIN (P<0.01)， and there was a significant positive correlation between expression of DNA ploidy and MVD. Acini of PC were completely negative for both basal cell markers (34βE12 and p63)， but were positively different in the BPH and among different grades of PIN， which were in contrast to the results for the acini cells of revealed varying degrees of expression of P504s in the PC and HGPIN， and acini of BPH and LGPIN were negative. Conclusion MVD and DNA ploidy were correlated to the biological properties of PIN， and thus were important parameters. HGPIN is a precancerous change of prostatic carcinoma by expression of MVD and DNA ploidy and these immunophenotypes.
KEY WORDS: prostatic intraepithelial neoplsia (PIN); prostatic carcinoma (PC); microvascular density (MVD); DNA ploidy; immunohistochemistry
前列腺上皮内瘤(prostatic intraepithelial neoplasia， PIN)是一种较常见的病理现象，具有发展为浸润癌的潜能。85%的前列腺癌(prostatic carcinoma， PC)中可以找到PIN的存在。作为前列腺癌的癌前病变，PIN已成为近年来研究的热点，但目前尚缺乏反映其生物学特性的指标。研究认为，肿瘤微血管密度(microvascular density， MVD)是反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数[1]，细胞核DNA倍体是反映肿瘤细胞增殖能力的重要生物学定量指标[2]，前列腺基底细胞特异性标记物P63、34βE12与前列腺癌特异性标记抗体P504s联合应用是鉴别前列腺肿瘤良恶性的最佳指标[3]。本研究应用免疫组织化学SP法和计算机图像分析技术，对24例前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia， BPH)、23例低级别上皮内瘤(lowgrade prostatic intraepithelial neoplasia， LGPIN)、26例PC伴高级别上皮内瘤(highgrade prostatic intraepithelial neoplasia， HGPIN)的石蜡包埋标本进行CD34、P63、34βE12和P504s表达的检测，并定量测定其中MVD和细胞核DNA倍体，探讨其与PIN发生、发展及癌变的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集我院1995年2月～2005年1月间临床病理资料完整的经尿道前列腺切除或电切标本73例。其中PC伴发HGPIN 26例，在同一例该标本中，选取癌组织作为PC组，癌旁组织作为HGPIN组，患者年龄48～93岁，平均(68.73±8.99)岁；同期收检BPH伴发LGPIN(LGPIN组)23例，年龄60～81岁，平均(68.35±6.53)岁；BPH 24例，作为对照组，年龄60～85岁，平均(70.67±6.51)岁。
1.2 主要试剂及仪器
CMIAS真彩色病理图像分析系统购自北航图像中心与空军总医院医学图像研发中心。免疫组织化学所用一抗(鼠抗人单克隆抗体CD34和兔抗人单克隆抗体34βE12、P63、P504s)及其试剂盒购自Dako公司；Fulgen染色所用的Schiff试剂购自上海化学试剂厂。
1.3 方法
组织均经100mL/L甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，HE染色复查。
1.3.1 CD34、34βE12、P63和P504s表达的检测
采用免疫组织化学SP法。步骤如下：标本切片脱蜡、水洗，抗原修复，滴加羊血清封闭，滴加一抗，PBS洗片；滴加二抗(室温孵育)，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。工作液浓度分别为1∶80、1∶70、1∶70、1∶30。TBS代替一抗作空白对照，用标本中间质大血管和已知前列腺癌及其正常组织作阳性对照。
1.3.2 MVD和细胞核DNA倍体的检测
以CD34阳性标记的单个细胞和内皮细胞簇作为一个血管标记(图1A)，先在低倍镜(×100)下观察，再在高倍镜(×200)下选择微血管数量最多的5个视野，计数MVD，求其平均值作为测定标本的MVD值。采用Fulgen法染组织的细胞核后，在CMIAS真彩色病理图像分析系统下进行DNA倍体测定。每例测定间质淋巴细胞(参照细胞)50个，前列腺上皮细胞(分析细胞)50个，校正因子1.1。
1.3.3 DNA倍体的判定标准
①2C及近2C：1.8～2.5C；②4C及近4C：2.5～4.5C；③异多倍体≥5.0C。
1.3.4 免疫组化染色的判定标准
P63以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，P504s和34βE12均以细胞质内有棕黄色颗粒为阳性。显微镜下观察5个高倍视野，将阳性细胞按其数量分为3个等级：阳性细胞数<10%为(+)，阳性细胞数>60%为()，阳性细胞介于两者之间为()，显色强度与背景无明显差别者为(-)；+为灶状阳性，为阳性，为强阳性，-为阴性。
1.4 统计学处理
采用SPSS11.0统计软件。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，检测指标间的相关性检测采用双变量直线相关分析。以α=0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 MVD、DNA倍体的测定结果
LGPIN组和HGPIN组的MVD和DNA平均倍体明显高于BPH组(P<0.01)，而明显低于PC组(P<0.01)。在不同级别PIN组间，HGPIN组的MVD明显高于LGPIN组(P<0.01)，而两组间的DNA平均倍体无显著性差异(P>0.05)。DNA倍体的异多倍体数随BPH、LGPIN、HGPIN、PC的顺序逐渐增加(表1)。表1 PC、HGPIN、LGPIN和BPH中MVD和DNA倍体的测定结果（略）
2.2 MVD与DNA倍体的相关性
在BPH、LGPIN、HGPIN和PC中，DNA倍体与MVD间呈正相关关系(r=0.547)，即MVD值越高，DNA平均倍体值越大。
2.3 34βE12、P63和P504s的表达情况
光镜下HE染色显示， BPH组前列腺导管和腺泡上皮细胞呈单层排列，细胞核大小和形态一致；LGPIN组前列腺导管和腺泡上皮细胞层次增多， 细胞核增大，大小略不一致，核仁不明显。免疫组化染色显示，34βE12和P63在BPH和LGPIN组均有阳性表达，即：腺体周的基底细胞呈连续阳性表达，P504s呈阴性。HGPIN组是在LGPIN的基础上出现核形态不规则，可见核仁， 免疫组化34βE12和P63呈灶状阳性表达，即：腺体周的基底细胞呈断续阳性(图1B、图1C)，P504s呈灶状阳性。PC组细胞呈大小不等的腺泡、腺样或筛状或实体团状，核有不同程度的异型，核仁可明显。免疫组化P504s呈强阳性表达(图1D)，而34βE12和P63呈阴性。
2.4 34βE12、P63、P504s表达与MVD、DNA倍体的关系
34βE12和P63在基底细胞呈连续阳性、而P504s呈阴性区，MVD值和DNA平均倍体低；34βE12和P63呈阴性、P504s强阳性区，MVD值和DNA平均倍体高；34βE12和P63断续阳性、P504s灶状阳性区，MVD值和DNA平均倍体介于前两者之间。
3 讨 论
PIN是指前列腺导管和腺泡上皮的异常增生，分为低级别和高级别，不仅与PC同时伴发，且可存在于BPH中。对基底细胞特异性标志物34βE12、P63和PC特异性标记物P504s联合进行免疫组织化学表达，可显示PIN特别是HGPIN与PC的异同[3]，以辅助诊断和鉴别诊断BPH、PIN和PC。本研究结果表明，34βE12和P63在BPH中腺体周围的基底细胞呈连续阳性，在PIN中随其级别的增高，基底细胞由连续阳性到断续阳性，在PC中呈阴性；相反，P504s在PC中呈强阳性，在HGPIN中呈灶状阳性，而在BPH和LGPIN中呈阴性。本结果与文献报道一致[3]。
近年来研究认为，MVD与肿瘤的发生、发展密切相关，微血管生成是肿瘤生长的必要条件[1]。在PIN中微血管的数目介于BPH和PC之间，且微血管较短，血管轮廓不规则[4]。本研究结果显示，LGPIN组和HGPIN组的MVD明显高于BPH组(P<0.05)，而明显低于PC组(P<0.01)，且随PIN级别的升高，MVD增加。与文献报告一致[45]。说明在PIN中微血管形成的增加，促进肿瘤细胞的合成代谢，加速排泄酸性及毒性代谢产物，为瘤细胞快速生长和癌变提供物质基础。提示MVD与PIN及其癌变关系密切，是反映PIN生物学特性的重要参考指标。
本研究结果还显示，PIN组的细胞核DNA平均倍体介于BPH和PC之间，且开始出现异多倍体，并随其级别的升高，异多倍体数逐渐增加。与李清等[6]的报告一致。提示PIN的细胞增殖状态介于正常上皮与癌之间，为肿瘤性增生，且随其级别的升高，细胞增殖活性逐渐接近癌，具有发展为浸润癌的潜能。进一步证实，PIN特别是HGPIN是PC的癌前病变。说明DNA倍体可作为反映PIN发生、发展的重要参考指标。同时，测定其病变的DNA平均倍体，对BPH、PIN和PC的诊断和鉴别诊断有一定的参考价值[2，6]。在不同级别的PIN间，DNA平均倍体无显著性差异，可能与测量时所选目标的处理、灰度等因素有关。
双变量直线相关分析显示，DNA倍体与MVD间呈正相关关系。在BPH和LGPIN中，34βE12和P63呈连续阳性、P504s呈阴性，MVD值和DNA平均倍体值低；在PC中，34βE12和P63呈阴性、P504s呈强阳性，MVD值和DNA平均倍体值高。在HGPIN中，34βE12和P63呈断续阳性、P504s呈灶状阳性，MVD值和DNA平均倍体值介于前两者之间。
总之，MVD和DNA倍体与PIN密切相关，且随其级别的升高而增加，是反映其生物学特性的重要参考指标；免疫表型进一步证实PIN特别是HGPIN是PC的癌前病变。
参考文献
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[6]李清，杨金瑞，李解方. DNA倍体与前列腺癌生物学特性的关系 [J]. 陕西医学杂志， 2007， 36(5):545547