大鼠三叉神经节离体培养可用于血管性头痛发病机制和药物治疗的靶点研究

　　　　作者：罗国刚，雷莉，吕社民，樊文静，徐仓宝

【摘要】 　　目的 颈动脉血降钙素基因相关肽水平升高是引发血管性头痛发作的重要原因之一，本研究探讨血管性头痛的发生机制和药物作用靶点的理想体外模型。方法 SD大鼠三叉神经节在无血清DMEM培养液中离体培养12、24、48h后免疫组化方法比较降钙素基因相关肽(CGRP)阳性细胞数表达水平，实时定量PCR法(real timePCR)确定CGRPmRNA表达水平的变化。结果 大鼠三叉神经节离体培养24h后CGRP的免疫阳性表达细胞数明显增高，CGRPmRNA表达水平也较新鲜组明显增高(P均<0.05)。结论 大鼠三叉神经节离体培养后能精确模拟体内血管性头痛发作期CGRP的变化，是研究血管性头痛发生机制和开发药物作用靶点的理想体外模型。

【关键词】 三叉神经节；离体培养；降钙素基因相关肽；体外模型

　　ABSTRACT: Objective To explore an ideal model for primary vascular headache in studying pathogenesis and new medication therapeutic target in vitro. Methods Trigeminal ganglion (TG) of SD rats was isolated and cultured in serumfree DMEM medium for 12h， 24h and 48h. Then the calcitonin generelated peptide (CGRP) positive stained cells were detected by using immunohistochemistry staining， and realtime polymerase chain reaction (RTPCR) was used to determine mRNA expression changes of CGRP. Results The TG cultured in serumfree DMEM for 24h had a significant increase in the CGRPpositive stained cell number and upregulated strikingly CGRPmRNA expression compared with fresh TG (P<0.05). Conclusion The TG after explant culture with serumfree medium exactly simulates the pivotal change in primary vascular headache attack， which always manifests the increased release of neuropeptides， such as CGRP. Therefore， explant culture of rat TG is an ideal model in vitro for studying pathogenesis and new therapeutic target primary vascular headache.

　　KEY WORDS: trigeminal ganglion; explant culture; calcitonin generelated peptide; in vitro model

　　血管性头痛人群发病率约16%～20%[1]，在全球造成的经济负担重于脑血管病。血管性头痛急性发作时三叉神经血管系统激活，三叉神经节逆向释放以降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide， CGRP)为代表的血管活性肽类物质明显增多，当 CGRP释放降至基线水平时头痛缓解[24]。未来10年治疗偏头痛最有效、最安全、最持久的药物将是CGRP拮抗剂[56]。目前，研究血管性头痛发病机制的动物模型有血管源性机制模型、三叉神经节刺激模型、硬脑膜神经源性炎症模型、皮层扩布性抑制(CSD)模型、CACNA1A、ATP1A2和SCN1基因相关模型等[79]。但是，以上动物模型都不能精确模拟出头痛急性发作时CGRP的变化规律，也不利于开发药物作用的新靶点。本研究把大鼠三叉神经节离体后在无血清的DMEM培养液中培养一定时间观察以CGRP为代表的血管活性肽类物质的变化规律，旨在寻求一种血管性头痛发生机制和开发药物作用新靶点理想的体外研究模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 大鼠三叉神经节离体培养模型的建立

　　成年雄性SpragueDawley(SD)大鼠，SPF级，体重250～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。戊巴比妥钠腹腔内注射(40mg/kg，必要时追加剂量)麻醉后在750mL/L酒精中浸泡消毒3min，断头处死用止血钳沿枕骨大孔处逐层剥开颅骨、颞骨，刮掉大脑小脑暴露三叉神经，轻轻剪断三个感觉根取出神经节，在冷的PBS(phosphate buffer saline， PBS)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中剔除神经节周围的血管、脂肪、神经鞘膜等结缔组织后，成乳白色为止，置入4℃ PBS液中保存备用。24孔培养板内每孔盛2mL DMEM(Dulbeccos modified eagles medium. Sigma， USA)培养液(加青霉素100u/mL和链霉素100mg/L以及两性霉素B 25mg/L)。37℃恒温培养箱中培养，持续通以含50mL/L CO2的O2使pH值保持在7.4左右，每24h更换培养液1次。

　　1.2 免疫组化法测定三叉神经节内CGRP阳性细胞数

　　离体培养24h后的三叉神经节浸入含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L PBS磷酸缓冲液过夜。所有三叉神经节用振动切片机冠状位上均匀切成30μm厚度的切片，组织切片都收集在含3mL/L Triton X100(PBST)和30mL/L过氧化氢PBS液中，用1mL/L牛血清白蛋白封闭抗体1h，然后与兔多克隆CGRP抗体(Sigma，USA，1∶2500稀释)4℃下共同孵育72h后，再用PBST冲洗，接着用含生物素的羊抗兔IgG抗体(vector laboratories，1∶2000稀释)4℃下搅拌孵育过夜。进一步漂洗2次后，组织切片置于1∶1000亲和生物素复合物(vector laboratories)稀释液中2h。PBS冲洗，4min×3次；DAB显色(Sigma)；最后组织切片用Tris盐酸缓冲液漂洗后置于凝胶载玻片上，加盖玻片前用中性红复染。由另一研究者双盲法普通光镜观察，然后荧光显微镜(Olympus)观察，采用SCIONIMAGE图像分析软件扑捉所有原始图像，256阶灰度反转亮度，细胞光密度测量时图像放大10倍分析图像。CGRP阳性反应细胞数、平均光密度和累积光密度测量和计算都用百分比。图像分析时剔除染色不均、皱褶或泪滴样图像。双向方差分析法Scheffe′比较各组CGRP阳性反应细胞百分比，显著性检验概率取P<0.05。

　　1.3 实时定量RTPCR测定mRNA表达水平的变化

　　离体培养的三叉神经节用FastPrepA试剂盒(QBIOgene，CA，USA)中1mL RNA proTM液(QBIOgene，CA，USA)匀浆处理，按程序提取总RNA。cDNA的逆转录采用Gene Amp RT试剂盒(PE Applied Biosystems)，PerkinElmer 2400 PCR扩增仪扩增42次30min。RTPCR采用GeneAmp SYBR Green PCR试剂盒(PE Applied Biosystems)，PerkinElmer PCR仪(PE， GeneAmp 5700)。引物序列根据基因数据库，应用引物表达2软件设计，CGRP(M34090)前引物Forward：5′GAGGCAGCTACAAGGTTCAGG3′，后引物Reverse：5′AGGTGTTGGTGCTGGACACA3′；大鼠PACAP前引物Forward：5′ACTCTGTCTTCTACATCTCTCTCCTCG3′，后引物Reverse：5′AGGGAGCGTGACACCGAA3′；大鼠nociceptin前引物Forward：5′：AGTGAGTTTATGAGGCAGTACCTG3′，后引物Reverse：5′GCGTTGGCTTGACTGCATG3′。管家基因(house keeping gene)分别以GAPDH(前引物：5′GGCCTTCCGTGTCCTACC3′，后引物：5′CGGCATGTCAGATCCACAAC3′)和βactin(前引物：5′CTATCGGCAATGAGCGGTTCC3′，后引物：5′TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG3′)作为内对照。PCR反应体系为50μL，开始50℃ 2min，95℃ 10min，然后在95℃ 15s和60℃ 1min循环40次，反应结束后采用分离曲线分析法确定反应产物的特异性。数据定量分析采用PCR循环阈值CT (cycle threshold，CT)比较法，以GAPDH的CT 值为内对照，计算CGRP、垂体腺苷酸环化酶激活的多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptides， PACAP)和镇痛素(nociceptin)等物质mRNA的相对表达量。标准曲线根据CT=lg[浓度/(1+E)]方程绘制，E代表扩增效率，是根据标准曲线的斜率计算而得，理想斜率为3.3，理想扩增效率为100%。标准曲线验证CGRP和GAPDH的cDNA在PCR反应体系中扩增效率相同[12]。统计分析采用配对t检验，显著性概率取P<0.05。

　　1.4 统计分析

　　计量资料以均数±标准差(±s)表示。应用GraphPad Prism (version 4.0)统计软件，Oneway方差分析，方差分析前先做正态性检验和方差齐性检验，所有资料都符合正态分布但部分资料方差不齐，故采用方差分析Dunnetts点检验和Welchs校正后非配对的t检验，检验的显著性水准取P<0.05。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠三叉神经节离体培养后血管活性肽mRNA表达水平的变化

　　大鼠三叉神经节离体培养后血管活性肽类CGRP、PACAP 和nociceptin的mRNA 相对表达量较新鲜组明显增高(P<0.05或P<0.01，图1)。再以βactin作为内对照，观察CGRPmRNA相对表达量的变化(图2)。

　　2.2 大鼠三叉神经节CGRP免疫阳性细胞表达的变化

　　免疫组化染色显示新鲜的和离体培养后的三叉神经节内都有CGRP免疫反应阳性细胞表达，但在新鲜组表达量很低，而离体培养后12、24、48h后CGRP阳性反应细胞数表达水平显著增高(P<0.05或<0.001)，培养12h的阳性细胞数最多(图3白空心箭头所示，黑实心箭头所示为CGRP免疫反应阴性细胞)。由图3可见CGRP主要表达在三叉神经节内中小型神经元，CGRP阳性细胞呈棕褐色，胞体染色深浅不一，部分细胞中心部位着色浅，周围胞浆点状着色，似菊花样，部分细胞浆内染色致密均匀，中心部位略淡，胞体圆形、卵圆形及不规则形，染色深浅与胞体大小无关。

　　2.3 三叉神经节离体培养后CGRP免疫组化切片的图像分析

　　对大鼠三叉神经节离体培养后CGRP免疫组化切片图像进一步分析，结果显示CGRP阳性反应细胞数的百分比、表达面积、平均荧光光密度和累积光密度值(IOD)都显著高于新鲜未培养组(P<0.05，图4)。

　　3 讨 论

常见的血管性头痛包括偏头痛、丛集性头痛和慢性反复发作性头痛等，累积人群发病率约25%～40%。据WHO统计血管性头痛是全球致残性和造成经济负担前二十位疾病之一。血管性头痛具体的发病机制目前并不十分清楚，有血管源性学说、神经源性学说、三叉神经血管系统激活学说、5羟色胺及受体活化学说等[1，1011]。但是，有一个现象是大家公认的：偏头痛、丛集性头痛和慢性反复发作性头痛发作期三叉神经血管性头痛激活，三叉神经节内逆向释放以降钙素基因相关肽(CGRP)、血管活性肠肽(VIP)、P物质(SP)、垂体腺苷酸环化酶激活的多肽(PACAP)和镇痛素(nociceptin)等多种血管活性肽类物质明显升高，疼痛缓解后其释放水平降至基线，血管性头痛时颈动脉血中CGRP升高，而SP和PACAP不高[1214]。因此，CGRP最具代表性，无论通过药物、针刺、经颅磁刺激等方法只要降低CGRP的释放水平就可以缓解头痛。上世纪七八十年代推出特效抗头痛剂Triptan类药物重要作用环节就是选择性激动脑底部血管壁5HT1B受体使血管收缩对抗CGRP的扩血管作用，激活三叉神经节内5HT1B/1D 受体抑制CGRP逆向释放，使CGRP水平降至正常而缓解头痛[23]。最新型的抗头痛药物CGRP受体拮抗剂BIBN4096BS在欧洲正进行Ⅲ期临床试验，已显示出良好效果[1516]，美国LIPTON和SHEFTELL在最新一期《Headache》上报道未来十年CGRP拮抗剂可使偏头痛急性期治疗更彻底、更持久和更安全[5]。所以，目前血管性头痛发生机制的研究重点和药物作用新靶点开发都集中在三叉神经内CGRP合成、释放、表达调控等环节。

头痛是一种主观感觉，无法取材，引发头痛的内外刺激源和影响因素复杂多变，很难直接进行人体实验等，都限制着血管性头痛发生机制的深入研究。国内外学者建立的经典血管性头痛模型就是基于以上学说应用物理、化学或生物等因素作用于动物，造成动物局部组织、器官或全身性损害，出现与人类头痛发作时类似的功能、代谢或形态结构等方面病变。常用动物模型有硬脑膜、三叉神经节、上矢状窦的电或化学刺激引发的神经性炎症型模型；KCl或机械针刺诱导的大鼠皮层扩散型抑制模型；皮下注射硝酸甘油所致的血管性偏头痛模型；利血平致5HT耗竭伴局部脑血管痉挛的小鼠偏头痛模型；家族性偏瘫型偏头痛(familial hemiplegic migraine， FHM)基因相关性模型等[5，710]。但是，以上传统的动物模型都不能精确模拟出血管性头痛发作期CGRP的变化规律，也不能在体外精确控制各种因素后深入研究发病机制，而且三叉神经节内包含支配咀嚼肌的运动纤维、电或化学刺激三叉神经节后冲动上传缺乏特异性、CGRP阳性纤维定量困难、刺激硬脑膜引发的神经源性炎症是逆行性的，分离上矢状窦后影响静脉回流、脑脊液外漏、血液进入蛛网膜下腔激惹感觉神经末梢等缺点。建立一个理想的体外模型精确模拟出血管性头痛急性发作期CGRP的释放变化规律是目前深入研究其发病机制和开发新药物的关键。我们的既往研究将大鼠肠系膜上动脉离体培养一定时间后，血管平滑肌细胞膜G蛋白偶联受体调变规律非常类似于高血压、糖尿病、脂质代谢紊乱等病理状态下血管粥样硬化改变，从而成为血管粥样硬化发生机制研究的理想模型[1718]，启发我们考虑三叉神经节体外培养模型是否也能用于血管性头痛发生机制的研究。本研究将SD大鼠三叉神经节离体后置于无血清改良的DMEM培养液中培养12～48h后，发现CGRP、PACAP、nociceptin等血管活性肽类mRNA表达水平明显增高，与血管性头痛发作期CGRP释放增高的核心表现完全吻合，其原因可能是当三叉神经节置于体外营养物质缺乏、缺血缺氧、神经节内分泌的炎性因子、神经生长因子等诱发局部神经源性炎症反应而激活血管活性肽类物质表达，正好模拟出血管性头痛发作期体内CGRP变化过程。离体的三叉神经节保留了神经元细胞体、神经纤维和部分神经鞘膜、髓鞘等主要结构组织[12]。三叉神经节离体培养是器官水平的研究模型，即克服了单纯细胞培养条件单一，培养结果和细胞反应与生物体内实际情况相差较远的局限性，又能在保留活体细胞和细胞外基质的前提下精确控制各种因素后深入研究血管性头痛发生机制和预防策略，如在体外培养液中加入精确浓度的炎症因子、Triptan类药物、CGRP拮抗剂、细胞内信号转导通路关键性蛋白激酶抑制剂等干预下，观察三叉神经内CGRP表达的变化，从而在分子和细胞内信号转导水平上揭示CGRP合成、释放、表达调控等细胞内机制，为开发特效防治血管性头痛药物作用新靶点提供实验数据。三叉神经节离体在无血清中培养模拟“Stress”环境因素，并能引起无菌性炎症进一步激活MAPK通路，引起CGRP升高。本实验室初步研究已经证实ERK1/2信号转导通路特异性阻滞剂U0126能显著降低三叉神经细胞内CGRP合成水平，说明ERK1/2信号通路可能参与了CGRP表达调控，这或许是未来药物研制的一个方向。利用此模型，我们也已初步阐明三叉神经节内CGRP表达增高是在基因转录水平和蛋白质翻译水平上神经性炎症反应的结果。所以，三叉神经节离体培养是研究血管性头痛发生机制和开发药物作用新靶点的良好模型，利用此模型可进一步研究炎性因子IL1、IL6、TNFα和中药提取物天麻皂甙、全蝎多糖对CGRP表达水平的影响。

参考文献

　　[1]EDVINSSON L. Aspect on the pathophysiology of migraine and cluster headache [J]. Pharmacol & Toxicol， 2001， 89(2):6573.

　　[2]EDVINSSON L. Novel migraine therapy with calcitonin generegulated peptide receptor antagonists[J]. Expert Opinion Therapeutic Targets， 2007， 11(9):11791188.

　　[3]EDVINSSON L， GOASDSBY PJ. Neuropeptides in headache [J]. Eur J Neurol， 1998， 5(4):329341.

　　[4]DURHAM PL. Calcitonin generelated peptide (CGRP) and migraine [J]. Headache， 2006， 46(6):5358.

　　[5]LIPTON RB， SHEFTELL FD. Moving forwardessential questions for the next 10 years [J]. Headache， 2009， 49(S1):4346.

　　[6]TEPPER SJ， STILLMAN MJ. Clinical and preclinical rationale for CGRPreceptor antagonists in the treatment of migraine [J]. Headache， 2008， 48(8):12591268.

　　[7]姜磊，于生元，董钊. 实验性偏头痛动物模型研究现状 [J]. 中国比较医学杂志， 2008， 18(8):6264.

　　[8]徐世军，沈映君，郭际，等. 偏头痛动物模型述评 [J]. 四川生理科学杂志， 2005， 27(1):4041.

　　[9]郝嘉楠，牛争平. 偏头痛的动物模型研究进展 [J]. 西医结合">中西医结合心脑血管疾病杂志， 2005， 3(12):10821085.

　　[10]王玲玲，范吉平. 偏头痛动物模型在中药研究中的应用 [J]. 中华中医药学刊， 2007， 25(4):760761.

　　[11]XIAO Y， RICHTER JA， HURLEY JH. Release of glutamate and CGRP from trigeminal ganglion neurons: Role of calcium channels and 5HT1 receptor signaling [J]. Mol Pain， 2008， 16(4):12.

　　[12]KURIS A， XU CB， ZHOU MF， et al. Enhanced expression of CGRP in rat trigeminal ganglion neurons during cell and organ culture [J]. Brain Research， 2007， 1173(10):613.

　　[13]THALAKOTI S， PATIL VV， DAMODARAM S， et al. Neuronglia signaling in trigeminal ganglion: implications for migraine pathology [J]. Headache， 2008， 48(2):299300.

　　[14]MA QP， HILL R， SIRINATHSINGHJI D. Colocalization of CGRP with 5HT1B/1D receptors and substance P in trigeminal ganglion neurons in rats [J]. Eur J Neurosci， 2001， 13(11):20992104.

　　[15]EDVINSSON L， PETERSEN KA. CGRPreceptor antagonism in migraine treatment [J]. Lancet， 2008， 372(9656):20892090.

　　[16]PETERSEN KA， BIRK S， LASSEN L， et al. The CGRPantagonist， BIBN4096BS does not affect cerebral or systemic haemodynamics in healthy volunteers [J]. Cephalalgia， 2005， 25(2):139147.

　　[17]罗国刚，曹永孝，徐仓宝，等. ERK1/2通路参与大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞ETB受体上调的表达 [J]. 药学学报， 2006， 41(3):257262.

　　[18]罗国刚，马爱群，徐仓宝，等. ERK1/2通路参与ETA和ETB受体介导的离体肠系膜上动脉收缩研究 [J]. 中国药理学通报， 2005， 21(3):343347.