川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用

【摘要】 目的 观察川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用。方法 原代培养大鼠海马神经元，培养基中加入1mmol/L的盐酸川芎嗪溶液共同孵育12h后，加入1mmol/L谷氨酸损伤海马神经元20min。采用MTT法检测细胞活性;测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH )活力的变化;细胞免疫组化检测各组细胞表达AchE。 结果 川芎嗪可提高谷氨酸损伤后海马神经元的存活率，抑制因谷氨酸损伤引起的细胞内LDH的释放，可促进谷氨酸损伤细胞中AChE的表达。 结论 川芎嗪对谷氨酸诱导海马神经元损伤有保护作用。

【关键词】 川芎嗪;谷氨酸;海马神经元

: Objective To observe the protective effects of ligustrazine on glutamateinduced injury in cultured hippocampal neurons. Methods Primarily cultured hippocampal neurons from fetal rats were incubated with ligustrazine (1mmol/L) for 12 hours， then glutamate (1mmol/L) was added for 20 minutes to induce injury. Cell viability was detected by MTT assay， and the change in LDH activity was determined by biochemical method. Finally， the expression of AchE in the cultured neurons was assayed by immuocytochemistry. Results Ligustrazine improved the survival rate of hippocampal neurons injured by glutamate， inhibited the release of LDH from the kytoplasm injured by glutamate. The expression of AchE in the injured neurons was promoted by pretreatment of ligustrazine. Conclusion Ligustrazine can significantly exert protective effects on the hippocampal neuron injury induced by glutamate.

　　KEY WORDS: ligustrazine; glutamate; hippocampal neuron

　海马是边缘系统的重要组成部分，参与学习、记忆、情绪反应及植物神经功能等。原代培养的海马神经元对许多致病因素和化学损害较为敏感，是研究神经元损伤及抗损伤的理想模型。在脑缺血模型中，海马神经元的损伤较为严重，其中兴奋性氨基酸含量增高是海马神经元损伤的原因之一。谷氨酸(glutamate， Glu)是哺乳动物脑内主要的兴奋性氨基酸，参与中枢神经系统的信息传递。但Glu过度释放可产生神经兴奋性毒性，引起神经细胞损伤或死亡。川芎嗪(ligustrazine， Lig)是从中药川芎总生物碱中分离得到的一种有效活性生物碱。Lig能通过血脑屏障进入中枢神经系统，在脑中快速达到峰值，并持久地存留在大脑内。临床上常用Lig治疗脑缺血，其机制是通过扩张微血管改善微循环，抑制血栓形成，阻断自由基连锁反应，降低细胞内钙离子超载，拮抗氨基酸毒性等途径来实现，具有多靶点、多层次、多环节的脑保护作用[1]。本研究采用体外海马神经元原代培养，观察Lig对Glu损伤海马神经元的保护作用，探讨Lig对脑损伤神经元的保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 实验动物采用健康孕期15d孕鼠，由第四军医大学实验动物中心提供;盐酸Lig注射液为哈尔滨三联药业有限公司生产;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO) 、L多聚赖氨酸、阿糖胞苷为美国Sigma公司产品;胰蛋白酶、DMEM培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青有限公司产品;6孔板/Ⅱ96孔板为丹麦Costar公司产品;乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。Olympus倒置相差显微镜(日本)，CO2培养箱(NAPCO公司)，酶联免疫检测仪(美国BIOTek公司)，兔抗大鼠AchE抗体(1∶1000)、羊抗兔IgG(1∶200)、ABC及DAB显色试剂盒(美国VECTOR公司)。

　　1.2 海马神经元的原代培养[2] 健康孕15d的SD大鼠，麻醉后无菌条件下取胎鼠脑，解剖显微镜下取出的双侧海马，去除脑膜和血管，2.5g/L胰酶37℃消化10min，用完全培养基(90% DMEM+10% FBS)终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的24孔/96孔细胞培养板，置于50mL/L CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。12h后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的过度增殖，以后每周换液2次，每次换1/2培养液。培养至神经元分化完全后进行实验。

　　1.3 海马神经元Glu损伤模型的建立及分组[3] 海马神经元按上法培养7d后，去除原来培养基，用Lockes液(154mmol/L NaCl、5.6mmol/L KCl、 3.6mmol/L NaHCO3、2.3mmol/L CaCl2、5.6mmol/L Glucose、5mmol/L HEPES，pH 7.4)洗涤细胞3次，每次5min。谷氨酸损伤组，以Lockes液配制1mmol/L Glu 20～22℃作用于培养细胞20min，撤除Glu，用Lockes液洗涤细胞3次，每次5min，重新加入原培养基继续培养12h。实验组用Lockes液含有1mmol/L Lig加入细胞中培养12h后，再加入Glu作用20min。对照组Lockes液无Glu和Lig。

　　1.4 免疫细胞化学染色 海马神经元按上法培养7d后，除去培养液，用0.01mol/L PBS洗涤一次，加入40g/L多聚甲醛，室温下固定1h，去除固定液，用0.01mol/L PBS室温下洗涤10min，共3次。用含50mL/L羊血清、含1mL/L Triton X100的PBS液在37℃条件下封闭30min，去除封闭液。滴加一抗(rabbit antiACh monoclonal antibody，1∶1000)，4℃放置过夜，PBS洗。滴加二抗(goat antirabbit IgG， 1∶200 )，室温放置2h，PBS洗。实验中设不加一抗的空白对照组，除以PBS代替一抗外，其余步骤同上。DAB显色，显微镜下观察免疫细胞化学染色结果。用Image Pro Plus 6.0图像分析软件行细胞灰度值检测，每张爬片随机取5个视野，每个视野随机取10个细胞，取其平均值。

　　1.5 MTT法检测海马神经元的活性 各实验组每孔加10μL MTT(5g/L)放入37℃、50mL/L CO2培养箱中培养4h。然后每孔加人100μL浓度为200mg/L SDS，继续培养12h，用酶联免疫检测仪测定570nm的吸光度。每个实验组设8个复孔，实验重复3次。吸光度比值代表细胞活力。以空白对照组作为参照，其细胞生长率为100%。各组生长率=(各组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。

　　1.6 乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 收集培养基上清液，剩余培养液-20℃冰箱冻存7h之后，解冻，按试剂盒说明分别测定原上清液LDH的活性和培养板中剩余培养液冻溶后的LDH活性，计算LDH漏出率。

　　LDH漏出率(%)=上清液LDH活性/(冻溶后细胞培养液LDH活性+上清液LDH活性)×100%

　　1.7 统计学处理 实验数据应用Graph Pad Prism 5.0统计软件分析。数据以均数±标准差(±s)表示，显著性检验采用单因素方差分析。以P<0.05作为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 海马神经元的培养 相差显微镜下观察发现，体外培养2h大部分细胞己经贴壁生长，此时可见少数神经元伸出1～2个突起。培养至2d突起增多，但神经元突起的联络较少。培养7d时，神经元胞体呈椭圆形或三角形，胞体周围光晕明显，反光均匀一致，立体感强，神经元突起的主干和分支明显延长、增粗，相互联系增多(图1)。

　　2.2 1mmol/L Lig对Glu诱导海马神经元保护作用的形态学变化 Glu作用于细胞20min，继续培养12h后显微镜下观察，发现部分细胞变圆，胞体肿胀，细胞失去原有形态，突起淡化、减少或消失。细胞内、外出现较多的黑色颗粒，贴壁不牢，折光性下降(图2)。 Lig保护组与Glu损伤组相比，神经元的胞体较完整，大部分细胞的存在少量的突起。细胞突起存在少量的联系，突起的数量较正常组减少。

　　2.3 AChE免疫细胞化学染色结果 镜下可见棕色颗粒为阳性反应物，免疫组化阴性对照组未见此棕色颗粒。阳性神经元呈现三角形、椭圆形或圆形，突起明显。阳性反应物主要分布在细胞胞浆中，细胞核及突起着色较淡。与正常对照组和Lig保护组相比较，Glu损伤组细胞明显浅淡(图3)。对免疫组化结果进行半定量分析，结果发现正常组细胞的平均灰度值为148.6±9.88，Glu损伤组细胞的平均灰度值为171.5±6.87，Lig保护组平均灰度值为151.0±12.37。统计分析结果表明正常组灰度值低于Glu损伤组(P<0.01)，Lig保护组灰度值低于Glu损伤组(P<0.05)，正常组和保护组之间无统计学差异(表1)。表1 Lig对Glu损伤培养海马神经元的保护作用

　　2.4 Lig对Glu损伤的海马神经元活性和LDH的影响 MTT法检测各组海马神经元活性(表1)。结果显示，与对照组相比，Glu损伤后细胞活性显著下降(P<0.001); Lig保护组与Glu损伤组相比细胞活性明显升高(P<0.05)。Glu损伤后12h，分别检测各孔培养上清中LDH的活力(表1)。结果显示Glu损伤可导致海马神经元LDH释放显著增加，表现为培养上清LDH活力显著增加(P<0.01)，1mmol/L 的Lig可显著抑制Glu损伤神经元LDH的释放(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　Lig是中药川芎的有效成分，在治疗缺血性脑血管病等方面疗效肯定，而且对中枢神经系统损伤有较好的修复作用。研究表明Lig可明显抑制皮质和海马NOS阳性细胞增多，与NOS拮抗剂LNAME(10mg/kg)的作用相似;脑缺血时使用盐酸Lig注射液可显著降低细胞外兴奋性氨基酸神经递质Glu和天冬氨酸(Asp)的浓度[4]。Glu是哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸之一。许多中枢神经系统疾病可引起Glu的过度释放，从而产生严重的神经兴奋毒性，引起神经元损伤或死亡。海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一。与皮层神经元相比，海马神经元易纯化而且含有高密度的Glu受体[5]。原代培养细胞比细胞株更接近生理状态的生物学特性，选用其探讨药物的作用机制具有实际意义。因此，本研究选用原代培养大鼠海马神经元，模拟体内高浓度Glu条件，研究Lig对抗Glu兴奋性毒性作用，以探讨Lig保护神经元损伤的可能机制。

　　本实验结果表明，Lig可以保护Glu诱导的神经元损伤。在细胞培养过程中，Lig保护组神经元的胞体接近正常培养状态下的细胞形态，细胞贴壁情况较Glu损伤组明显改善。同时，MTT结果表明，Lig保护组细胞活性明显得到提高，降低Glu引起的神经细胞死亡率。LDH漏出率实验表明，Glu能引起神经细胞内大量LDH的释放，LDH释放率可反映细胞膜的通透性及完整性[6]，而Lig能明显降低神经细胞LDH的释放，说明Lig能很好的保护细胞膜的稳定性。乙酰胆碱是中枢神经系统一种重要的神经递质，海马内有丰富的胆碱能神经递质存在，其纤维主要来源于隔区的内侧隔核和斜角带垂直支的胆碱能神经元。胆碱酯酶(AChE)的基本作用是快速水解神经终末的乙酰胆碱，在哺乳动物皮质有AChE的表达，海马中非胆碱能神经元也有表达[78]。研究发现，在早期培养胚胎海马神经元中可大量表达AChE，随着培养时间的延长，其表达量逐渐下降。AChE对发育过程中海马Glu能神经元树突的形成至关重要[9]。本实验结果表明，Glu的细胞毒性抑制了细胞合成AChE，表现为细胞的突起减少、突起与突起之间的联系减少、相应的突触结构减少，结果影响了神经元的生长。相反，Lig明显可以对抗Glu的毒性作用，促进细胞AchE的合成，促进神经细胞的发育成熟。当然，Lig保护Glu介导的细胞毒性作用的详细机制还有待进一步研究。

参考文献

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