Src激酶在脊髓背角长时程增强的诱导和维持中的作用

【摘要】 　　目的 探讨Src激酶在大鼠脊髓背角C纤维诱发电位长时程增强(LTP)的诱导和维持中的作用。方法 细胞外记录技术在脊髓腰膨大部记录背角浅层神经元C纤维诱发电位。结果 ①Src激酶的选择性抑制剂Genistein(200μmol/L)或PP2(100μmol/L)对脊髓背角C纤维诱发电位的基础电位没有影响，但可阻断脊髓背角LTP的诱导。②Genistein或PP2呈时间依赖性逆转脊髓背角LTP。在LTP诱导后15min，脊髓局部给予Genistein(200μmol/L)或PP2(100μmol/L)可完全逆转LTP。但是，同样浓度的Genistein或PP2在LTP诱导后30min，均不能逆转业已建立的LTP。结论 脊髓背角Src激酶的激活参与C纤维诱发电位LTP的诱导和早期维持。

【关键词】 Src激酶；长时程增强(LTP)；脊髓背角；痛觉过敏

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the role of Src kinase in the induction and maintenance of spinal longterm potentiation (LTP). Methods The Cfiber evoked field potentials were recorded at the superficial layers of spinal dorsal horn at the lumbar enlargement. Results ① Genistein (200μmol/L) or PP2 (100μmol/L)， a selective Src kinase inhibitor， completely blocked LTP induction when administered at 30min prior to tetanic stimulation. ② Genistein or PP2 reversed spinal LTP in a timedependent manner. At 15min after LTP induction， Genistein (200μmol/L) or PP2 (100μmol/L) reversed LTP completely. At 30min after LTP induction， however， the same concentration of Genistein or PP2 did not affect the spinal LTP. Conclusion Activation of Src kinase in spinal dorsal horn may be crucial for the induction and earlyphase maintenance of LTP of Cfiber evoked field potentials.

　　KEY WORDS: Src kinase; longterm potentiation (LTP); spinal dorsal horn; hyperalgesia

　　海马长时程增强(longterm potentiation， LTP)是学习、记忆的神经基础。LTP也存在于脊髓背角，电刺激C纤维及自然伤害性刺激或急性神经损伤可使脊髓背角C纤维诱发电位产生LTP。脊髓背角C纤维诱发电位的LTP介导病理性疼痛，脊髓背角LTP意味着痛觉可在脊髓背角形成记忆[12]。已有研究表明，Src的激活对于海马LTP的诱导是必需的[3]。有证据表明，Src的表达和磷酸化参与了伤害性刺激引起的中枢敏感化的形成[4]，但Src在脊髓背角突触传递可塑性变化中的作用还不清楚。为阐明Src激酶在脊髓背角LTP的诱导和维持中的作用，本研究应用Src激酶的抑制剂Genistein与PP2，在LTP诱导前、后，直接局部作用于脊髓节段表面，观察其对C纤维诱发电位LTP的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及准备

　　采用SD雄性大鼠250～280g。体重230～280g。乌拉坦(1.4g/kg，ip.)麻醉。行常规气管插管和颈外静脉插管。在胸13～腰1(T13～L1)行椎板切除术，暴露脊髓腰膨大。游离左侧坐骨神经，使用双极氯化银电极刺激坐骨神经。颈外动脉插管持续监测动脉血压，其波动范围为10.67～13.33kPa(80～100mmHg)。用热反馈系统使大鼠直肠温度维持在37～37.5℃。

　　1.2 主要试剂

　　Genistein(Sigma)、Genistin(Sigma)与PP2(Calbiochem)首先分别溶解于二甲亚砜(dimethylsulfoxide， DMSO; Sigma)，均配制为40mmoL/L的储存液，在临用前用9g/L NaCl溶液分别稀释成200μmol/L(Genistein或Genistin)与100μmol/L(PP2)的工作液。工作液中DMSO的终浓度不超过7.0mmoL/L。将15g/L的琼脂(溶解于153.8mmoL/L NaCl溶液)加热使其完全液化后，冷却至38℃，倾倒于暴露的脊髓表面，在其上方挖一个小井，便于在脊髓表面给予药物。

　　1.3 电生理记录和神经刺激

　　脊髓背角C纤维诱发电位的记录方法如文献[56]所述。用钨丝微电极(电阻0.5～1MΩ)进行细胞外记录，电极深度在脊髓表面下(100～500)μm。用数/模转换器(DT2821F16SE)以10kHz速度处理和储存数据。以C纤维诱发电位的面积作为参数。单方波(10～20V，0.5ms，1min)刺激分离的左侧坐骨神经以诱发脊髓C纤维诱发电位，强直刺激(40V，0.5ms，100Hz，持续1s，间隔10s，4次)诱导C纤维诱发电位LTP。坐骨神经的刺激点到脊髓背角记录点的距离约11cm。实验结束时给予过量戊巴比妥钠处死大鼠。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据以C纤维诱发电位面积的均数±标准误表示，均数间差异的显著性检验组内用Wilcoxon signed ranks检验，组间用Friedman检验。

　　2 结果

　　2.1 Genistein或PP2阻断C纤维诱发电位LTP的诱导

　　为阐明Src激酶在脊髓背角LTP诱导中的作用，在LTP诱导前加入酪氨酸蛋白激酶的抑制剂Genistein。在脊髓背角浅层记录C纤维诱发电位至少30min作为基线，在脊髓表面加入Genistein (200μmol/L)作用30min，其对C纤维诱发电位面积的影响无统计学意义[(101.9±8.5)%]。随后在坐骨神经上施加强直刺激，强直刺激后1h的C纤维诱发电位面积为(108.9±10.6)%(P>0.05， n=6， 图1A)。另一个Src激酶的高特异性阻断剂PP2在强直刺激前30min给药产生与Genistein相同的效应(图1B)。

因Genitein或PP2均溶解于DMSO，为排除DMSO本身可能影响C纤维诱发电位或基本的突触传递，在脊髓表面给予与工作液同样剂量的DMSO。在整个实验记录过程中，7.0mmoL/L DMSO并不影响C纤维诱发电位，并且该浓度的DMSO并不影响脊髓背角LTP的诱导和维持(资料未显示)。为排除Genistein抑制脊髓LTP是通过药物的非特异性效应而不是直接抑制Src激酶的活性这种可能性，观察了Genistein的非活性类似物Genistin对脊髓LTP诱导的影响，发现强制刺激前30min给予Genistin，仍可诱导出脊髓背角C纤维LTP(P<0.05，n=6，图1C)。

　　2.2 Genistein或PP2呈时间依赖性逆转C纤维诱发电位LTP

　　在强直刺激诱导出LTP的不同时间(15min，30min)于脊髓表面加入Genitein或PP2，以评价Src激酶是否参与脊髓LTP的维持。

强直刺激诱导出LTP 15min后给予Genitein(200μmol/L)，药物作用25min后C反应面积由(209.2±11.2)%降至(176.1±6.5)%(P<0.05， n=8， Wilcoxon signed ranks test， 图2A)。在药物作用150min后C反应面积下降至(119.1±10.4)%，与基线相比不再有统计学差异(P>0.05， Wilcoxon signed ranks test， 图2A)。

　　诱导出LTP 30min后，记录节段脊髓表面加入Genitein(200μmol/L)并不能影响脊髓LTP。在给药前C反应面积为(200.8±10.1)%，与用药后至少3h C反应面积比较无统计学差异(P>0.05， n=6， 图2B)。
　　
　　为排除药物对脊髓LTP维持的非特异性作用，观察了另一Src激酶的高特异性阻断剂PP2对业已建立的LTP的影响。给予PP2 100μmol/L，药物作用40min后C反应面积由(212.2±10.2)%降至(182.9±10.2)%(P<0.05， n=7， Wilcoxon signed ranks test， 图3A)。在用药后3h使C纤维诱发电位降至 (115.4±9.8)%，与对照水平不再有统计学差异(P>0.05， Wilcoxon signed ranks test， 图3A)。诱导出LTP 30min后，发现同样浓度的PP2对LTP的维持无明显抑制作用(P>0.05， n=6， 图3B)。

　　3 讨论

　　在海马的研究表明，非受体酪氨酸激酶Src可直接磷酸化NMDA受体，并与NMDA受体一起免疫共沉淀，Src的抑制剂能阻断或抑制海马LTP的诱导，直接激活突触后神经元的Src可增强兴奋性突触后反应[78]。Src的激活对于海马LTP的诱导是必需的[3]，Src诱导的AMPA受体 EPSCs 是Ca2+依赖性的，而NMDAR EPSCs是非Ca2+依赖性的[9]。本文结果表明Genistein或PP2能够阻断脊髓背角C纤维诱发电位LTP的诱导，说明Src激酶的活性增强在LTP的诱导中发挥重要作用。

海马CA1区NMDA依赖性的LTP至少分为两个时相：早期LTP(ELTP)与依赖蛋白质和RNA合成的晚期LTP(LLTP)。LLTP的诱导依赖于基因表达，而Src激酶的激活可上调NMDA受体的功能[8]。本文结果表明，Src激酶的抑制剂Genistein或PP2呈时间依赖性抑制脊髓LTP的维持。有证据表明，Src的表达和磷酸化参与了伤害性刺激引起的中枢敏感化的形成[4]。上述研究表明，Src激酶家族参与了脊髓背角突触传递可塑性变化和伤害性刺激引起的痛觉过敏。

脊髓背角C纤维诱发电位LTP很可能与中枢敏感化有关，翻转脊髓LTP可缓解病理性疼痛。本文研究表明Src激酶的抑制剂不仅可完全阻断脊髓LTP的诱导，而且呈时间依赖性抑制脊髓LTP。但是，如何抑制或者翻转脊髓背角的晚期LTP的表达或维持，从而缓解中枢病理性疼痛，有待进一步的研究。

参考文献

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　　[6]杨红卫，张红梅，信文君， 等. 8BrcAMP对脊髓背角C纤维诱发电位LTP的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2005， 26(1):1215.

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