作者：杨维娜，于琳华，郭尚温，成少利，柴云
【摘要】 目的 探讨阿霉素肾病在不同病理发展阶段动物模型的制作。方法 采用间隔2周两次尾静脉注射阿霉素的方法复制大鼠阿霉素肾病模型，观察各组大鼠血、尿生化指标和肾组织病理学的改变。结果 该模型表现为严重水肿、大量蛋白尿、低蛋白血症和高脂血症;病理学检查显示，4周末肾小球足细胞肿胀，系膜细胞轻度增生;8周末有球囊粘连，肾小管上皮细胞萎缩;12周末部分肾小球节段性轻、中度硬化，间质内有明显灶性淋巴细胞浸润，并有轻度纤维化。结论 经改良间隔2周两次尾静脉内注射阿霉素4mg/kg，可以成功复制阿霉素肾病模型。急性模型病理学改变类似人的微小病变性肾病，慢性模型病理学改变类似人的局灶节段性肾小球硬化。
【关键词】 阿霉素肾病;足细胞;微小病变性肾病;局灶节段性肾小球硬化
ABSTRACT: Objective To study the adriamycin nephrosis model in different development pathological stages. Methods The rat adriamycin nephrosis model was established by injecting adriamycin into tailvein twice every two weeks to detect blood and urina biochemical indicators and to observe the pathological changes of the renal tissues. Results The model showed serious edema， proteinuria， hypoproteinemia， and hyperlipidemia. Podocytes were swollen and mesangial cells developed mild hyperplasia at the end of the fourth week. The nephric tubule atrophied at the end of the eighth week accompanied with adhesion between glomeruli and Bowmans capsule. Glomeruli sclerosis of mild or medium degree was observed at the end of the twelfth week with obvious lymphocyte infiltration in the renal interstitium as well as the formation of collagen fibers. Conclusion The adriamycin nephrosis model was successfully developed by injecting adriamycin 4mg/kg into tailvein twice every two weeks. The acute model is similar to human minimal change disease， and the chronic model is similar to human focal segmental glomerulosclerosis.
KEY WORDS: adriamycin nephropathy; podocyte; minimal change disease; focal segmental glomerulosclerosis
阿霉素肾病(adriamycin nephropathy)动物模型是继嘌呤霉素肾病动物模型后的另一种在肾脏病研究领域中广泛应用的动物模型。阿霉素(adriamycin， ADR)诱导的肾病模型可分为急性模型和慢性模型。急性模型病理学改变类似人的微小病变性肾病(minimal change disease， MCD)，慢性模型病理学改变类似人的局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis， FSGS)。我们在实际应用过程中发现，文献报道的造模方法或多或少存在一些缺陷。因此，我们在以往研究的基础上，对阿霉素肾病模型进行了改良。以期为研究不同病理发展阶段的肾小球疾病提供一种更好的动物模型。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂 健康清洁级雄性SD大鼠60只，重180～220g左右，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。注射前大鼠经适应性标准饲养3d，尿蛋白均为阴性。将大鼠随机分为阿霉素肾病模型组(40只)和正常对照组(20只)。注射用盐酸阿霉素10支，10mg/支，由浙江海正药业股份有限公司生产。批准文号：国药准字H33021980。
1.2 模型的制作 阿霉素肾病模型组于实验开始后第4天、第18天分别从尾静脉注射ADR 4mg/kg(阿霉素按2g/L溶于生理盐水中，即2mL/kg);对照组于实验开始后第4天、第18天分别从尾静脉注射等容积生理盐水，放入代谢笼内饲养，自由摄食、饮水。从第2次注射后连续观察至12周末。存活的大鼠第2次注射ADR后7、14d时检测尿蛋白，尿蛋白定量>100mg/24h提示模型复制成功，计入实验。
1.3 大鼠的血、尿的生化检测 各组均于第1次阿霉素注射前1d、第2次阿霉素注射后1周末、4周末、8周末及12周末用代谢笼收集24h尿液，用量杯测尿量，摇匀取3mL，3000r/min，离心5min，去除沉渣，-20℃冰箱保存待测。阿霉素组于收集尿液结束当天随机各取大鼠10只、对照组相应每次随机取大鼠5只，乙醚吸入麻醉，心脏穿刺采血，室温下2h内离心，3000r/min，离心5min，取血清，-20℃冰箱保存待测。用柳氮磺酸比浊法检测尿蛋白。用日立7600A全自动生化仪检测血清总蛋白(total protein， TP)、白蛋白(albumin， ALB)、胆固醇(cholesterol， ChoL)、甘油三酯(triglyceride， TG)、血尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)及血肌酐。
1.4 病理形态学的观察 分别于1周末、4周末、8周末及12周末收集尿液及心脏穿刺采血后处死大鼠，剖腹取肾，分为二部分，分别用FAA和25mL/L戊二醛固定。进行如下观察：①光镜观察。肾组织经FAA固定、乙醇脱水、石蜡包埋后，制成3μm厚的石蜡切片，做普通HE、PAS染色及Masson特殊染色，Olympus光学显微镜下观察肾组织形态学的改变。②透射电镜观察。肾组织取出后切成1mm3的小块，经25mL/L的戊二醛固定、1g/L磷酸盐缓冲液浸洗、10g/L四氧化俄固定、1g/L磷酸盐缓冲液浸洗、乙醇梯度脱水、环氧树脂EPON812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2u，美蓝染色后光学显微镜下定位，超薄切片机进行超薄切片50～70nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色后透射式电子显微镜下观察、拍照。
1.5 肾小球病理变化的半定量分析 采用MOTIC病理图像分析系统对肾小球病理变化进行半定量分析。应用PAS染色标本，每组选6个样本，每例样本均在40倍显微镜下随机选取10个肾小球输入计算机，采集系膜基质着色区，画定肾小球毛细血管襻区域，进行肾小球的病理图像分析，分别得出10个肾小球系膜基质面积/肾小球毛细血管襻面积比(肾小球系膜基质相对面积)的平均值，为基质增多的相对含量;并测量每个肾小球中5个开放最大的毛细血管直径以观察毛细血管开放程度[1]。人工观察并计算肾小球硬化指数：将切片中每个肾小球硬化程度分为0～4级。0级：肾小球基本正常;1级：肾小球硬化面积≤25%;2级：25%<肾小球硬化面积≤50%;3级：50%<肾小球硬化面积≤75%;4级：75%<肾小球硬化面积≤100%，肾小球硬化指数(GI)=[(1N1+2N2+3N3+4N4)/每切片的肾小球总数]×100%，式中N1、N2、N3、N4分别代表1级、2级、3级、4级损害的肾小球个数[2]。
主要观察指标有肾小球硬化指数、肾小球毛细血管丛管腔开放程度(μm)、PAS阳性区面积(μm2)、毛细血管襻横截面积(μm2)和肾小球系膜基质相对面积(%)。
1.6 统计学处理 应用SPSS12.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理，所有数值以均数±标准差表示，两组间的比较应用方差齐性检验后，采用t或t′检验，多组间的比较应用单因素方差分析后，采用LSD检验做各组间均数的两两比较。P<0.05表示有统计学意义。
2 结 果
2.1 一般情况 模型组40只大鼠于阿霉素注射后第5天均出现不同程度的腹泻，食量下降且活动减少，至第10天腹泻停止，活动逐渐恢复。第3周出现轻度水肿，以足、腹、睾丸较明显。第4、5周水肿加重，第6周部分鼠出现不同程度的腹水现象。期间3只大鼠死亡，1只制备模型失败被剔除。模型成功率达90%。对照组大鼠健康存活。
2.2 各组大鼠尿蛋白的定量分析 阿霉素组第2次注射ADR 1周末、4周末、8周末、12周末24h尿蛋白定量与同期正常对照组相比有显著性差异(P<0.01)，且随时间延长24h尿蛋白定量逐渐增高，12周末达高峰(表1)。
2.3 各组大鼠血生化指标的检测 对照组无明显异常;第2次注射阿霉素4周末，阿霉素组血清总蛋白、白蛋白开始下降(P<0.05)，8周末明显下降，12周末达最低值;甘油三酯、总胆固醇4周末开始升高(P<0.05)，8周末达高峰，12周末略有下降;血尿素氮、血肌酐4周末变化不明显，8周末开始升高(P<0.05)，12周末明显升高，表明已有肾功能的损伤(表2)。表1 各组大鼠24h尿蛋白定量的动态变化*P<0.05 vs. control
2.4 大鼠肾组织的形态学变化 肉眼观察：正常对照组无异常。阿霉素肾病模型组1周末、4周末各组肾组织均无明显改变;8周末、12周末均见肾皮质色苍白，部分皮质、髓质分界不清。
光镜观察：正常对照组无异常。阿霉素肾病模型组1周末可见肾小球毛细血管淤血，肾小球基底膜(glomerular basement membrane， GBM)完整，肾小管内有极少量蛋白管型，间质血管充血;4周末可见肾小球足细胞肿胀、毛细血管淤血，部分肾小球系膜细胞轻度增生，肾小管内有较多蛋白管型，间质血管高度充血(图1A);8周末可见肾小球足细胞肿胀明显，并有球囊粘连，部分肾小球肥大，毛细血管腔变窄，肾小管上皮细胞萎缩，管内蛋白管型较前增多(图1B);12周末可见肾小球肥大明显，肾小囊扩张，囊壁增厚，球囊粘连明显，部分肾小球节段性轻、中度硬化，肾小管广泛灶状扩张，蛋白管型更多，肾间质小动脉管壁增厚、管腔狭窄，间质内有明显灶性淋巴细胞浸润，并有轻度纤维化(图1C、D、E)。对肾小球进一步进行的病理图象分析结果显示：模型组1周末和4周末的肾小球硬化指数、肾小球毛细血管丛管腔开放程度、PAS阳性区面积、毛细血管襻横截面积、肾小球系膜基质相对面积与对照组比较无统计学意义;8周末和12周末与对照组、1周末、4周末比较有统计学意义(P<0.05)，表明已有FSGS的发生(表3)。
电镜观察：正常对照组的肾小球足细胞足突正常，GBM完整，均匀一致。阿霉素肾病模型组1周末可见肾小球足细胞足突扁平、融合;4周末可见肾小球毛细血管内皮及足细胞肿胀、足突融合变扁平，足细胞微绒毛样改变，系膜区轻度增宽，GBM厚薄不均，肾小管粗面内质网扩张，上皮空泡变(图2A);8周末足细胞足突减少，系膜细胞增生，系膜区中度增宽，系膜基质中度增生，GBM部分增厚，肾小管萎缩，间质增宽(图2B);12周末足细胞足突广泛融合、消失，肾小球毛细血管丛与囊壁粘连，GBM增厚和塌陷，间质内有淋巴细胞浸润，纤维母细胞增生和胶原纤维形成(图2C、D、E)。同一肾小球中病变不同，有的足突广泛融合，有的足突存在，证明病变是局灶节段性的。表3 各组大鼠肾小球的病理变化特点
3 讨 论
阿霉素是含醌的蒽环抗生素，可在肾脏内代谢还原为半醌型自由基。后者与氧反应产生活性氧，诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应，影响糖蛋白代谢，破坏滤过膜的结构和功能，最终导致膜滤过屏障的选择性变化而引起蛋白尿[3]。阿霉素的肾毒性作用及大量蛋白尿的刺激，进一步诱发肾小球内固有细胞及其他炎性细胞产生并释放各种细胞因子和炎性介质，刺激肾小球系膜细胞增殖和系膜基质增多，缓慢发展形成肾小球硬化[4]。急性阿霉素肾病模型，即单次经鼠尾静脉注射5～7.5mg/kg阿霉素而诱发的，与人类微小病变性肾病相似，为国内外公认的微小病变性肾病模型，慢性阿霉素肾病模型是指通过多次注射阿霉素，或合并应用一侧肾切除的方法而诱导的局灶节段性肾小球硬化。
我们前期研究曾建立5/6肾切除肾血流动力学改变引起足细胞损伤的FSGS模型，但该模型不能动态观察MCD到FSGS的变化，而且手术操作复杂，容易合并感染，动物死亡率高，不适宜大批量实验。由于阿霉素对心脏、肝脏、骨髓、胃肠等系统具有较强的毒副作用，单次大剂量注射使得该模型死亡率偏高，虽然采用缩短建模时间和减少阿霉素用量的措施能提高模型存活率，但会影响建模效果。也有人采用右肾切除加重复注射ADR的方法造模，但实验中会因手术意外或感染造成大鼠死亡，而且在注射ADR后会增加大鼠的死亡率[5]。为了达到较好的造模效果，本实验参照文献对造模方法进行了改良。文献报道单次或多次经尾静脉注射ADR的最大剂量为7.5mg/kg。本实验采用两次尾静脉注射ADR复制阿霉素肾病模型，每次按4mg/kg剂量注射，两次注射剂量为8mg/kg，比最大剂量多0.5mg/kg。结果显示，阿霉素注射后大鼠出现腹泻的程度比单次大剂量注射减轻，病变程度和单侧肾切除加重复注射ADR相同，期间3只大鼠死亡，1只复制模型失败，被剔除。模型成功率达90%。
模型组第2次注射ADR后1周末尿蛋白开始增加;4周末出现典型的肾病综合征改变，即表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和严重水肿;12周末改变更明显。形态学检查肾组织病理学改变明显。这些结果提示间隔2周经鼠尾静脉两次注射(4mg/kg)ADR，可以成功复制阿霉素肾病模型，前4周为急性阿霉素肾病模型，与人的MCD相似。第4周到第12周为慢性阿霉素肾病模型，与人的FSGS相似。
经改良的造模方法有以下特点：①简便，易行，能降低动物死亡率，成功率高;②蛋白尿持续时间长，可持续3个月以上;③该模型鼠间病变差异小，重复性和稳定性好;④能够动态观察从MCD到FSGS的渐进发展过程。因此，该模型是进一步研究足细胞病变的一种较为理想的动物模型。
参考文献
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[3]陈继红，孙伟，高坤，等. 高脂饲料加速阿霉素肾小球硬化模型的建立 [J]. 南京中医药大学学报， 2007， 23(3):162163.
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