阿仑膦酸钠对长期应用皮质激素大鼠股骨头骨组织OPG/RANKL mRNA 表达的影响

　　　　 作者：王建忠，王坤正，时志斌，张明宇，赵斌修，杨华清

【摘要】 目的 观察阿仑膦酸钠对长期应用皮质激素大鼠骨组织中骨保护素(osteoprotegerin， OPG)/核因子κB受体活化因子配基(RANKL)mRNA表达的影响，探讨其预防激素性股骨头坏死的效果及作用机制。方法 健康SD大鼠30只，雌雄各半，随机分为激素组、阿仑膦酸钠组和空白对照组，每组10只。激素组和阿仑膦酸钠组给予肌肉注射醋酸泼尼松龙12.5mg/kg体重，每周2次，阿仑膦酸钠组同时给予阿仑膦酸钠5mg/kg体重灌胃，1次/周;对照组只给予相同体积生理盐水肌注。4周后取左侧股骨头骨组织，石蜡包埋，HE染色，鉴定骨质疏松和股骨头坏死情况;取右侧股骨头骨组织提取总RNA，采用实时定量聚合酶链反应(RTQPCR)技术检测OPG mRNA和RANKL mRNA的表达水平，计算OPG/RANKL比值。结果 激素组、阿仑膦酸钠组及对照组的动物死亡率分别为10%(1/10)、10%(1/10)、0(0/10);股骨头坏死率分别为66.67%(6/9)、22.22(2/9)、0(0/10);股骨头骨组织OPG mRNA的相对表达量分别为0.96±0.16、1.35±0.26和1.60±0.49，RANKL mRNA的相对表达量分别为3.33±1.04、1.98±0.51和1.58±0.42，激素组与对照组比较，其OPG mRNA的表达水平降低，RANKL mRNA表达升高，OPG/RANKL比值下降，差异有统计学意义(P<0.05);阿仑膦酸钠组与对照组比较，差异无统计学意义。结论 ①糖皮质激素醋酸泼尼松龙能下调大鼠骨组织OPG mRNA的表达水平，上调RANKL mRNA水平，使OPG/RANKL比值下降;②阿仑膦酸钠预防激素性股骨头坏死可能与其拮抗皮质激素对OPG mRNA和RANKL mRNA表达的调控有关。

【关键词】 阿仑膦酸钠;皮质激素;骨坏死;细胞因子

ABSTRACT: Objective To investigate the effects of alendronate on expression levels of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) mRNAs in bone tissues of femoral head of rats receiving longterm glucocorticoid administration， and to explore the effect and mechanism of alendronate in preventing glucocorticoidinduced femoral head necrosis. Methods Totally 30 healthy adult SD rats were randomly pided into 3 groups: glucocorticoid group， alendronate group and blank control group. The glucocorticoid group and alendronate group were treated by intramuscular injection of prednisolone， 12.5mg/kg， two times per week， and rats in the alendronate group were intragastrically administered with alendronate， 5mg/kg weight at the same time， one time per week. The control group was treated only by the same volume of intramuscularly injected sodium chloride. After 4 weeks intervention， osteoporosis and osteonecrosis of left femoral head were detected by HE staining， the total RNA of right femoral head bone tissue was extracted and the expression levels of OPG and RANKL mRNAs were examined by realtime quantitative polymerase chain reaction (RTQPCR). Results The mortality of rats was 10% (1/10)， 10% (1/10) and 0 (0/10) in glucocorticoid， alendronate and control groups. The osteoporosis and necrosis rates of femoral bone head were 66.67% (6/9)， 22.22% (2/9) and 0 (0/10) in the three groups， respectively. The level of OPG mRNA expression was 0.96±0.16， 1.35±0.26 and 1.60±0.49 in glucocorticoid， alendronate and control groups， while the expression of RANKL mRNA was 3.33±1.04， 1.98±0.51 and 1.58±0.42. The level of OPG mRNA expression was lower in the glucocorticoid group than in the control group; the level of RANKL mRNA expression was increased in the glucocorticoid group， whose OPG /RANKL ratio decreased significantly (P<0.05). The alendronate and control groups did not differ significantly. Conlusion ① Glucocorticoid significantly downregulated the level of OPG mRNA expression and upregulated RANKL mRNA expression， thus lowering OPG/RANKL ratio. ② Alendronate prevents glucocorticoidinduced osteonecrosis of femoral head， which may be correlated to alendronates counteracting with glucocorticiod in the regulation of expressions of OPG and RANKL mRNA.

　　KEY WORDS: alendronate; glucocorticoid; osteonecrosis; cytokine 骨保护素(osteoprotegerin， OPG)和核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand， RANKL)直接影响着破骨细胞的分化及其功能，共同构成调节骨重建的横轴旁分泌系统，是大多数生物活性物质介导骨吸收的最终和共有通路。在前期的研究中，我们发现激素性股骨头坏死模型股骨头骨组织OPG mRNA表达下调、RANKL mRNA表达上调，导致破骨细胞过度活化，增加骨吸收，引起股骨头骨质疏松，在应力作用下股骨头微骨折、小梁间微血管中断，最终导致股骨头缺血坏死。而在体外细胞培养和Pagets病患者研究中证实，二膦酸盐对OPG/RANKL有调控作用，因此我们设想阿仑膦酸钠作为二膦酸盐的代表性药物，可能在激素性股骨头坏死中对OPG/RANKL的表达也有一定作用。本研究采用实时定量聚合酶链反应(realtime quantitative polymerase chain reaction， RTQPCR)技术检测大鼠股骨头骨组织中OPG /RANKL mRNA的表达水平，旨在探讨阿仑膦酸钠在激素性股骨头坏死动物模型中的预防作用及其作用机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 3月龄健康SD大鼠30只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，雌雄各半，体重250～300g，单笼饲养，实验期间不限制饮食。

　　1.2 主要仪器与试剂 Real timePCR仪(美国ABI公司产品，ABI7000型);阿仑膦酸钠(石家庄欧意药业有限公司);醋酸泼尼松龙(湖北制药有限公司);骨组织RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录多聚酶链反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司);引物由大连宝生物工程有限公司合成。

　　1.3 动物造模、分组及药物处理 30只大鼠随机分为激素组、阿仑膦酸钠组和对照组，每组10只。激素组和阿仑膦酸钠组给予12.5mg/kg体重醋酸强的松龙肌注，阿仑膦酸钠组同时给予阿仑膦酸钠5mg灌胃，1次/周;对照组按同样的方法给予相同容积的生理盐水，2次/周。

　　1.4 骨组织学检查 用药4周后处死动物，取左侧股骨头，100mL/L中性甲醛溶液固定，依地酸(edetic acid， EDTA)脱钙，梯度酒精脱水，沿股骨头纵轴用石蜡包埋，切成5μm厚切片，HE染色，光镜下观察。

　　1.5 RTQPCR检测 采用Real timePCR仪检测大鼠骨组织中OPG mRNA和RANKL mRNA的表达水平。

　　1.5.1 骨标本总RNA的提取 处死大鼠，快速取出右侧股骨头，剔除软骨，置于盛有1mL Trizol的研磨器中仔细研碎并孵育5min，加氯仿沉淀，离心取上清;用等体积异丙醇沉淀RNA，离心去上清，750mL/L乙醇洗涤，风干后用焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate， DEPC)处理水溶解;电泳证实总RNA完整。

　　1.5.2 cDNA第1链的合成 取总RNA 500ng、随机引物1μL，加焦碳酸二乙酯处理水补至12μL，70℃水浴5min，冰上冷却;加入反应缓冲液4μL、dNTP 2μL、RNA酶抑制剂1μL，混匀后25℃水浴5min;加反转录酶MMLV RNase 1μL，配制成20μL反应液。恒温水浴25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min，-70℃保存。

　　1.5.3 OPG mRNA、RNAK mRNA表达的检测 根据目的基因在GenBank中的己知序列，采用primer premier 5.0设计引物，引物序列见表1。选25μL反应体系，取SYBR Primix 12.5μL、ROX Reference Dye 0.5μL、上下游引物各0.5μL、模板cDNA 50ng，采用Real timePCR仪，用三步法进行PCR反应。反应条件均为：预变性95℃ 35s，1个循环;变性95℃ 5s，退火58℃ 20s，延伸72℃ 35s，45个循环。通过ABI prism 7000 SDS 软件对各组目的基因作相对定量。并计算OPG mRNA和RANKL mRNA的比值。表1 实时定量PCR的引物序列

　　1.6 统计学处理 实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料均用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 三组大鼠左侧股骨头的组织学表现 对照组和阿仑膦酸钠组可见骨小梁由板层骨构成，多数小梁骨陷窝内可见骨细胞，小梁间为血管和骨髓;激素组板层骨不连续，骨陷窝内骨细胞大部分消失，周围有大量炎性肉芽组织(图1)。

　　2.2 三组大鼠骨组织OPG mRNA、RANKL mRNA的表达 激素组与对照组比较，OPG mRNA表达水平降低，RANKL mRNA表达升高，OPG/RANKL比值下降，差异有统计学意义(P<0.05);阿仑膦酸钠组与对照组比较，差异无统计学意义;阿仑膦酸钠组与激素组比较，OPG mRNA表达水平升高，RANKL mRNA表达降低，OPG/RANKL比值增高，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。表2 三组大鼠骨组织OPG mRNA、RANKL mRNA 的表达情况

　　3 讨 论

　　激素性股骨头坏死是一种常见病，约占非创伤性股骨头坏死的50%。5%～25%应用皮质激素的患者会发生股骨头坏死，在应用激素的SARS患者中，股骨头缺血性坏死的发生率更是高达53.5%[1]。股骨头坏死一旦发生，很难逆转，严重危害人们的健康和生活质量。虽然近年的关节置换术可以最终解决患者的行走问题，但由此也极大地增加了个体和社会的医疗成本。

　　在前期研究中，我们发现激素性股骨头坏死大鼠模型，股骨头骨组织中OPG mRNA的表达下调，RANKL mRNA表达上调，考虑激素性股骨头坏死的发生可能因其调节OPG/RANKL表达而导致破骨细胞过度活化，增加骨吸收引起股骨头骨质疏松，在应力作用下股骨头微骨折、小梁间微血管中断，最终导致股骨头缺血坏死。阿仑膦酸钠作为二膦酸盐家族最常用药物，被用来防治各种因素导致的骨质疏松，临床上取得了良好疗效。其作用机理可能与二膦酸盐通过调节成骨细胞OPG和RANKL表达，影响破骨细胞骨吸收有关[23]。最近研究又证实，二膦酸盐能够上调Pagets病患者血液中的OPG表达和下调其RANKL表达[4]，防治骨代谢异常。而本研究结果证实，阿仑膦酸钠可以通过拮抗激素对OPG/RANKL的调节作用，防止发生激素性骨质疏松，从而直接或间接预防激素性股骨头坏死。本研究为临床应用阿仑膦酸钠防治激素性股骨头坏死提供了实验依据。

参考文献

[1]陈卫衡，张强，刘道兵，等. SARS并发股骨头坏死的发病特点分析及临床意义 [J]. 中国骨伤， 2004， 17(7):388390.

　　[2]VIERECK V， EMONS G， LAUCK V， et al. Bisphosphonates pamidronate and zoledronic acid stimulate osteoprotegerin production by primary human osteoblasts [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 291:680686.

　　[3]吴小涛，王海军，韦继南，等. 帕米磷酸钠对大鼠成骨细胞RAN KL/OPG mRNA表达的影响 [J]. 江苏医药， 2007， 33(2):179181.

　　[4]MARTINI G， GENNARI L， MERLOTTI D， et al. Serum OPG and RANKL levels before and after intravenous bisphosphonate treatment in Pagets disease of bone [J]. Bone， 2007， 40(2):457463