HPLCELSD法测定桔梗中3种桔梗皂苷的含量

　　　　 作者：叶静，肖美添，汤须崇，黄雅燕

【摘要】 目的 建立测定桔梗药材中桔梗皂苷D、D3、E含量的方法。方法 采用高效液相色谱蒸发光激光闪射检测器(HPLCELSD)法，Hypersil C18柱(5μm，.6mm×150mm)，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，ELSD漂移管温度113℃，载气(N2)流速3.0L/min。　结果 桔梗皂苷D、D3、E的线性范围分别为13.78～275.6μg/mL(r=0.9995)、8.40～168.0μg/mL(r=0.9997)、12.02～240.4μg/mL(r=0.9996)，平均回收率(n=5)为98.3%、99.4%和101.3%。结论 本法操作简便，结果准确可靠，可用于桔梗皂苷D、D3、E含量的测定。

【关键词】 桔梗;桔梗皂苷;HPLCELSD

　　ABSTRACT: Objective To establish a quantitative method to determine the content of platycodin D， D3 and E in Radix platycodi.Methods High performance liquid chromatagraphyevaprorative light scattering dector (HPLCELSD) method was adopted. Platycodin D， D3 and E were separated by C18 (5μm， 4.6mm×150mm) with acetonitrilewater as mobile phase in a gradient program; flow rate was 1.0mL/min， the temperature of drift tube was set at 113℃， and the gas flow (N2) was set at 3.0L/min.Results The linear ranges of platycodin D， D3 and E were 13.78-275.6μg/mL (r=0.9995)， 8.40-168.0μg/mL (r=0.9997) and 12.02-240.4μg/mL (r=0.9996)， respectively. The average recoveries (n=5) were 98.3%， 99.4% and 101.3%， respectively.Conclusion The method is convenient， accurate and reliable， and can be used for the determination of platycodin D， D3 and E in Radix platycodoi.

　　KEY WORDS: Radix platycodoi; platycodin; HPLCELSD

　　中药桔梗(Radix platycodi)为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum (Jacq.)A.DC.的干燥根，在我国药用历史悠久，具有宣肺、利咽、祛痰和排脓之效[1]。桔梗皂苷为桔梗中主要有效成分，桔梗皂苷D和桔梗皂苷D3是桔梗中具祛痰作用的主要成分[2]。桔梗皂苷E于1999年由日本学者首先发现并确定其结构[3]。中国药典中对桔梗总皂苷含量的测定用重量法[1]，无桔梗皂苷D、D3和E含量测定方法的记录。近年来，国内外学者先后采用反相高效液相色谱法(RPHPLC)测定桔梗皂苷D，测得韩国桔梗根中的皂苷D含量为0.050%～0.090%[4];采用HPLC法比较了种植和野生的桔梗中桔梗皂苷A、C、D含量的差别[56];采用高效液相色谱紫外检测器(HPLCUV)或高效液相色谱蒸发光激光闪射检测器(HPLCELSD)测定不同产地、不同部位桔梗皂苷D、E的含量[79]。但未见同时测定桔梗皂苷D、D3、E的报道。由于这3种桔梗皂苷无强的发色基团，采用紫外检测器检测，末端吸收检测干扰较大，蒸发光激光闪射检测器(ELSD)能克服这一不足，是分析无紫外吸收和紫外吸收弱成分的有力工具。为考察国内不同产地桔梗中桔梗皂苷D、D3、E的含量，本文采用HPLCELSD法测定这3种桔梗皂苷含量，旨在为控制桔梗药材质量提供科学的分析方法。

　　1 仪器与试剂

　　Shimadzu SPD10A VP高效液相色谱仪(配备CBM102色谱工作站)，Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检测器，超纯水器(美国Milipore公司)。供试的桔梗药材购自江西省樟树药材市场，经本校刘青副教授鉴定为Platycodon grandiflorum(Jacq.)A. DC.的干燥根;对照品桔梗皂苷D、D3、E由本实验室制备型HPLC制备而得，经红外光谱(IR)、质谱(MS)、1H核磁共振(1HNMR)、13C核磁共振(13CNMR)等手段鉴定结构，HPLC法测定含量，以峰面积归一化法计算，含量均大于99.0%。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil C18柱(5μm，4.6mm×150mm);流动相：乙腈(A)水(B)，梯度洗脱(0～15min，A由15%线性变化到25%;15～30min，A由25%线性变化到35%;30～50min，A由35%变化到100%);流速1.0mL/min;柱温为室温;进样量：20μL;ELSD检测器检测参数：漂移管温度113℃;载气(N2)流速3.0L/min。色谱图见图1。

　　2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品桔梗皂苷D 6.89mg、桔梗皂苷D3 4.20mg、桔梗皂苷E 6.01mg，置于同一25mL量瓶中加适量甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。实验前过0.45μm滤膜，备用。

　　2.3 供试品溶液的制备 精密称取干燥粉碎过60目筛的桔梗药材1.0g，加入30mL甲醇超声提取3次，每次30min。合并提取液，浓缩蒸干，用甲醇定容至25mL量瓶中，作为供试品溶液。实验前供试品溶液经0.45μm滤膜过滤，备用。

　　图1 对照品(A)和湖南省样品(B)的HPLC色谱图

　　Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A) and a sample (B)

　　1：桔梗皂苷E;2：桔梗皂苷D3;3：桔梗皂苷D。

　　2.4 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10mL于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20μL。分别以峰面积的积分值为纵坐标，对照品的浓度(μg/mL)为横坐标，得桔梗皂苷D、D3、E的线性回归方程分别为：

　　Y=2440.9X-2291.2 r=0.9995

　　Y=3197.7X-943.40 r=0.9997

　　Y=1007.2X-790.38 r=0.9996

　　线性范围分别为13.78～275.6、8.40～168.0、12.02～240.4μg/mL。

　　2.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液20μL，连续进样5次，测得桔梗皂苷D、D3、E峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.82%、0.98%和0.87%，说明精密度良好。

　　2.6 重现性试验 取同一产地桔梗药材5份，精密称量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件测得桔梗皂苷D、D3、E的含量平均值分别为1.86mg/g、0.46mg/g和1.04mg/g，RSD分别为1.2%、1.6%和1.8%。

　　2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液20μL，分别在0、2、4、8、12和24h依次测定，测得桔梗皂苷D、D3、E峰面积的RSD分别为1.4%、

　　2.0%和1.6%。结果表明供试品溶液在24h内稳定。

　　2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量同批药材粉末(其中含桔梗皂苷D、D3、E的含量平均值分别为1.86mg/g、0.46mg/g、1.04mg/g)5份，每份约0.5g，加入混合对照品溶液3mL(含桔梗皂苷D 0.954mg、桔梗皂苷D3 0.244mg、桔梗皂苷E 0.534mg)，按“2.3”项下制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果桔梗皂苷D、D3、E的平均回收率(n=5)分别为98.3%、

　　99.4%和101.3%，RSD分别为2.0%、1.8%和1.9%。

　　2.9 样品测定 精密吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，重复3次，得桔梗皂苷D、D3、E峰面积平均值，代入回归方程计算，求得不同产地桔梗药材样品中桔梗皂苷D、D3、E的含量，结果见表1。表1 不同产地桔梗样品中桔梗皂苷D、D3、E的含量

　　3 讨 论

　　3.1 色谱条件的选择 实验先后应用不同比例甲醇水、乙腈水、甲醇10mL/L醋酸等度洗脱，结果分离效果均不理想，桔梗皂苷D、D3、E与相邻色谱峰达不到基线分离;采用乙腈水梯度洗脱后，获得较好的色谱峰分离效果。

　　3.2 ELSD检测器参数的设定 研究发现载气流速和漂移管的温度对ELSD的检测性能有较大影响，在仪器规定的参数范围内经反复实验，最终确定ELSD检测器的参数为雾化气体流速3.0L/min，漂移管温度为113℃。

　　3.3 供试品溶液的制备 在样品处理过程中，曾以水、不同比例的乙醇、甲醇为溶剂，回流提取、索氏提取和超声提取，结果表明以甲醇为溶剂，超声提取，样品中桔梗皂苷D、D3、E提取完全，而且操作简便。

　　3.4 测定结果分析 我国不同产地的桔梗中均含有桔梗皂苷D、D3、E，因产地不同，这3种桔梗皂苷在含量上有较大差别，其中以江苏产桔梗药材中桔梗皂苷D、D3、E的含量最高。本实验结果具有简便、快速、重现性好的特点，可作为桔梗药材质量控制的依据。

参考文献

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