微小RNA及其心血管病理生理学作用

【摘要】 微小RNA是近年发现的内源性非编码RNA小分子，主要在转录后水平调控基因表达，参与包括发育、肿瘤生成、病毒性疾病、免疫性疾病在内的多种生理及病理生理过程。微小RNA在心血管系统中也具有广泛的生物学作用。本文将就微小RNA在心血管病理生理中的作用作简要介绍。

【关键词】 微小RNA;心脏;血管

　　Molecular Cardiovascular Science， Ministry of Education， Beijing 100191， China)ABSTRACT: MicroRNAs (miRNAs) are endogenous noncoding RNAs discovered in recent years that posttranscriptionally regulate the gene expression. They are implicated in various biological processes including development， oncogenesis， viral and immunological diseases. Many miRNAs are highly expressed in the cardiovascular system and play an important role in cardiovascular health and diseases. In this paper， we briefly review the recent understanding of miRNAs and their role in cardiovascular pathophysiology.

　　KEY WORDS: microRNA (miRNA); heart; blood vessel

　　微小RNA(microRNA， miRNA)是一类进化上高度保守的单链非编码RNA小分子，由21～25个核苷酸组成，大部分由基因的内含子部位产生，主要通过抑制mRNA翻译或促进其降解从而调控基因表达[1]。

　　1993年，LEE等[2]研究发现lin4失功能突变后可改变秀丽隐杆线虫的发育周期。随后证实lin4是lin14和lin28的抑制因子。但是，lin4的编码产物并非蛋白质，而是一种微小的RNA转录物，从而揭开了miRNA的研究序幕。miRNA的发现揭示了调控mRNA的一种新模式，即除了通过经典的蛋白质和RNA的相互作用外，也通过RNARNA相互作用来实现。目前，经鉴定的miRNA约为9000多个，存在于动物、植物以及病毒中。人类miRNA为706个。LEWIS等[3]根据mRNA与miRNA种子序列保守互补性预测人类基因组中约30%的基因(5300个)受miRNA调控。在不同组织或不同发育阶段miRNA的表达不同，参与调控多种生物学过程如细胞增殖、分化、凋亡、发育、肿瘤、病毒性和免疫性疾病等。miRNA在心血管生理和病理过程中的作用也得到广泛的研究。其中一些miRNA特异表达于心血管系统，通过调控与细胞生长、分化、收缩以及电传导等密切相关基因的表达，在心血管发育及疾病中发挥着重要作用。本文就miRNA的一般特性及其与心血管病理生理过程和疾病的关系予以概述。

　　1 miRNA的生成、作用机制及命名

　　miRNA的生成始于细胞核，如图1所示，在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ作用下，由编码miRNA的基因转录生成单个或多个转录产物即初级miRNA(primarymiRNA， primiRNA)。这些初级miRNA通常具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。初级miRNA随后被由RNA酶Ⅲ核酸内切酶Drosha和DGCR8(RNA结合蛋白DiGeorge关键区域8)组成的复合物剪切，产生约70个核苷酸长度且含有一个茎环样结构的中间产物即前体miRNA(precursormiRNA， premiRNA)。Exportin5将前体miRNA转运至细胞浆，在RNA酶Ⅲ核酸内切酶Dicer的剪切下，形成miRNA双链结构(miRNA：miRNA*)。其中一条链miRNA*被降解，另一条链即成熟miRNA与argonaute蛋白以及Dicer结合，形成RNA诱导的沉默复合物miRISC，发挥转录调控作用。除此通路外，尚有一种不通过Drosha而仅通过Dicer的miRNA生成新途径[4]。miRISC复合物聚集于细胞质处理小体(Pbody)中，这些小体富含mRNA降解的酶类。在处理小体内，mRNA被储存或被降解处理[5]。合成的miRNA也可以被分泌至细胞外发挥功能[6]。此外，一些miRNA如miRNA29b的3′末端含有六核苷酸基序，使其重新回到细胞核中，推测可能与转录调控功能有关[7]。

　　miRNA通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′UTR)的碱基互补来识别靶基因并在转录后水平调控其表达。miRNA和靶mRNA之间碱基的精确互补通常导致靶mRNA直接被剪切。但是，多数miRNA与其靶mRNA碱基并不完全互补，而是通过成熟miRNA的5′末端6～8个碱基(种子序列)与靶mRNA的3′UTR的碱基配对来抑制靶mRNA翻译。该抑制作用可发生于mRNA翻译开始前和开始后等不同的阶段，如抑制起始因子4E依赖的起始[8]、延长[9]、降解新生的蛋白[10]等。此外，也有证据表明某些miRNA可促进基因转录[3]。RNA通常根据序列相似性，以“miR”为字首加一个数字来命名。例如，如果目前最新鉴定的已知miRNA是miRNA1300，下一个与先前所有已知miRNA核苷酸序列无相似性的miRNA就被命名为miR1301。不同物种的同源miRNA采用同一个名称。与已知miRNA高度同源仅一两个碱基不同的序列则以字母后缀区分，如miR23a和miR23b。如果在同一生物中，miRNA分别来自不同的基因座，则以数字后缀加以区别，如miR11和miR12。此外，星号表示较少表达的miRNA，如miR199a*[11]。

　　miRNA与siRNA、rasiRNA、piRNAs以及shRNA同属于小分子非编码RNA。miRNA与siRNA的区别是：miRNA是内源性RNA，由具有不完全互补碱基对发夹结构的单链前体RNA生成。siRNA主要由外源性的完全互补的双链前体RNA生成。在功能上，miRNA一般与靶基因不完全配对，而siRNA则与靶基因完全互补。但是，少数miRNA也可与其靶基因完全互补，后者实际上发挥与siRNA同样的效应。因此，miRNA与siRNA并不仅仅从作用机制来区分，也要从起源和生成过程来加以区别。

　　2 miRNA与心脏的病理生理

　　2.1 心血管系统中miRNA的表达 miRNA一个重要特点是具有组织特异性的表达模式。例如，对miRNA在心脏和血管中表达的研究发现，大鼠心脏和颈动脉miRNA表达不同，在心脏中主要以miR1、let7、miR126、miR133、miR26a、miR23和miR30c为主，而颈动脉中以miR145、let7、miR125b、miR125a、miR23和miR143为主，提示miRNA在不同组织中可能发挥不同的生理功能[12]。此外，miRNA的表达也具有时相性。例如，胚胎干细胞在分化过程中miRNA的表达发生改变[13]。因此，明确miRNA在心血管系统表达的组织与时间特异性是揭示其心血管生理功能与病理作用的基础。

　　2.2 心脏发育 为了理解miRNA在发育中的作用，其中一种方法就是阻断Dicer的功能，理论上使miRNA无法成熟和行使其功能。Dicer1缺失小鼠胚胎干细胞无法形成而死于胚胎发育早期[14]。GIRALDEZ等[15]发现母型合子型Dicer突变(RNase Ⅲ与dsRNA结合域突变)斑马鱼在原肠胚、脑形成时期出现形成异常，并伴随体节和心脏发育异常，提示miRNA参与了机体发育过程。因此，Dicer敲除的表型应该与Dicer作为miRNA生物合成的关键酶及其他作用有关。ZHAO等[16]发现心脏特异性Dicer缺失小鼠在胚胎期12.5d前因心脏发育缺陷如心包水肿以及心室肌发育不良而死亡，说明miRNA对于心脏发育至关重要。

　　除了通过Dicer敲除或突变造成miRNA成熟的普遍抑制以外，近年来人们进一步采用得功能和失功能方法探讨了特定miRNA在心脏发育中的具体功能。在心脏中高表达的miR1可通过调节Hrt2/Hey2、Hand1、Hand2、Gata6等关键蛋白调控心脏发育过程中祖细胞的增殖和分化平衡。miR1转基因鼠心室壁薄弱，主要原因是处于生长周期的心肌细胞数目减少以及分化不成熟[17]。miR1包括两个亚型miR11和miR12，在心脏中分布不同，miR11广泛分布，miR12表达则具有心室特异性。两者均是血清应答因子(SRF)的靶基因，通过作用于对心肌细胞发育和形态发生起关键作用的转录因子Hand2，负性调控心室肌细胞增殖。miR12缺失小鼠由于心脏发育缺陷而死亡，或者由于持续的心肌细胞肥大而致心室壁肥厚[16]。这些研究表明miR1及其亚型是精确调控心脏正常发育的重要因素。miR133家族包括miR133a1、miR133a2及miR133b，通常与miR1以双顺反子形式共同表达，受SRF调控，功能与miR1相反，主要抑制成肌细胞分化，促进细胞增殖。此外，转基因小鼠心脏部位过表达其他miRNA也会引起不同的表型，如miR195导致成年鼠心肌肥厚性生长;miR214不会引起显著的心脏发育缺陷;miR24过表达则会导致胚胎死亡[18]。这些研究提示心脏发育不仅仅受单个miRNA的影响，也同时受多种miRNA形成的复杂网络调控。

　　从细胞水平而言，虽然miRNA在人胚胎多能干细胞(HESC)中表达水平较低，但却是干细胞分化过程所必需的。例如，miR1可促进HESC向心肌细胞分化的表型改变;miR133虽可促进早期中胚层的分化，却抑制HESC进一步向心肌细胞定向分化[19]。因此，miRNA的调控是心肌细胞定向分化的一个新机制。

　　总之，近年较多的研究已揭示了miRNA在心脏发育中具有重要调控作用。进一步研究miRNA在祖细胞或干细胞分化成心肌细胞中的作用，不仅有助于阐明心脏发育的分子机制，也将为治疗性心肌细胞再生提供新的方法。

　　2.3 心肌重构和心力衰竭 心肌重构是心脏对于损伤或血流动力学改变发生的形态与结构的适应性反应。虽然心肌重构对于维持正常心脏输出是有益的，但长期的病理性重构则是心力衰竭及猝死的基础。越来越多的证据显示miRNA在心肌细胞及心肌组织生物学改变中具有重要作用。CHEN等[20]发现心脏特异性Dicer缺失小鼠出生后因发生迅速进展的扩张性心肌病乃至心衰而死亡。同时，心肌收缩蛋白表达异常，肌小节排列紊乱，心脏功能减低。他们进一步发现，与小鼠模型的表型类似，扩张性心肌病晚期患者发生心衰的心脏组织中Dicer的表达也降低。而且，Dicer的表达在使用左心室辅助装置使心功改善后升高，提示miRNA与扩张型心肌病以及心衰有密切关系。目前，研究了心衰患者、实验性动物模型如主动脉结扎、心肌过表达钙调素或Akt激酶持续激活型突变体、心肌肥大因子如血管紧张素Ⅱ、内皮素1和苯肾上腺素刺激的心肌细胞中miRNA的表达变化，发现包括miR21、miR23a、miR23b、miR24、miR195、miR208、miR214等在内的25种miRNA在以上的心肌样本中表达上调，腺病毒介导miR23a、miR23b、miR24、miR195或miR214过表达可诱导培养的心肌细胞肥大。相反，部分miRNA如miR150及miR181b表达下调，腺病毒介导过表达miR150或miR181b则降低心肌细胞的面积[18]。这些研究表明miRNA表达的特异性改变在心肌肥厚及心力衰竭病理过程中可能具有重要作用。

　　如前所述，miR1和miR133主要表达于心脏，调控心肌细胞分化和增殖。心肌肥厚和心房扩张患者以及多种心衰动物模型中miR1和miR133水平降低。过表达miR1可抑制心肌细胞核糖体S6蛋白磷酸化，抑制与心肌细胞生长有关的基因如RasGAP(Ras GTPaseactivating protein)、周期素依赖性激酶9(cyclindependent kinase 9， Cdk9)、Rheb(Ras homolog expressed in brain)及纤维连接蛋白等的表达，同时也可抑制血清和内皮素1诱导的心肌细胞肥大和心钠素的表达[21]。此外，miR1也通过负向调控钙调蛋白及其调控因子Mef2a及GATA4的表达而抑制大鼠心肌细胞肥大[22]。与之类似，过表达miR133也可抑制苯肾上腺素或内皮素1诱导的新生小鼠心肌细胞蛋白合成增加及细胞肥大反应，下调胚胎基因如αactin、αMHC及βMHC等的表达。相反，miR133缺失则引起显著的细胞肥大、蛋白合成及胚胎基因表达增加和心肌肥厚[23]。这些研究表明miR1和miR133在心肌肥厚及生长相关基因的表达方面具有类似的作用，但在心肌细胞凋亡方面则作用相反：miR1促进凋亡，而miR133则抗凋亡[24]。因此，miRNA及其靶基因是如何在相关通路中发挥不同的调控作用将有待进一步研究。

　　此外，已发现尚有其他miRNA参与心肌重构过程。如心肌特异性过表达miR195引起扩张性心肌肥厚表型，伴随心肌细胞肥大和胚胎基因活化[18]。miR21的表达在血管紧张素Ⅱ和苯肾上腺素诱导心肌细胞肥大以及主动脉结扎诱导的小鼠心肌肥厚中显著上调，而采用反义寡核苷酸封闭miR21可部分抑制新生大鼠心室肌细胞生长和蛋白合成[25]。同样的，miR21a参与核因子NFATc3调控的心肌细胞肥厚[26]。miR208是由αMHC内含子编码的心脏特异性miRNA，其缺失小鼠不发生钙调蛋白信号通路活化以及心脏压力负荷诱发的心肌肥厚，同时拮抗甲低引起的βMHC表达的升高。miR208可直接与甲状腺激素受体相关蛋白1(Thrap1)3′UTR结合而抑制其表达，提示miR208可能至少部分通过调控甲状腺激素信号通路发挥其功能[27]。

　　心肌纤维化，即心肌间质中细胞外基质的沉积，是心肌重构过程的一个重要组成部分，纤维组织的增加导致心肌顺应性下降，是影响心脏疾病预后的一个重要因素。研究发现Dicer条件性敲除的小鼠心肌组织同时发生心肌肥厚及纤维化[28]。多种特异的miRNA如miR208、miR29、miR133、miR30和miR21也参与调控心肌纤维化过程。ROOIJ等发现miR208缺陷小鼠拮抗主动脉结扎或钙调蛋白过表达所诱发的心肌纤维化，提示miR208在心肌纤维化中起关键作用。miR29在左冠状动脉前降支结扎患者缺血心肌边缘区组织以及在转化生长因子β(TGFβ)诱导的心脏成纤维细胞中表达下调。体内和体外敲低miR29b则促进胶原表达。相反，过表达miR29b的心脏成纤维细胞胶原表达减少，表明miR29是调控心肌纤维化的一个重要因子[29]。miR133和miR30可直接负向调控心肌细胞和心脏成纤维细胞中结缔组织生长因子(CTGF)表达而抑制心肌纤维化[30]。另外，敲低miR21可通过抑制ERKMAPK途径减少压力负荷诱导的小鼠心肌纤维化，改善心脏功能[31]。ROY等[32]的研究则进一步表明miR21也可通过PTEN通路调控心脏成纤维细胞基质金属蛋白酶2表达，参与心肌梗死后纤维化。

　　总之，越来越多的证据表明miRNA参与了心肌重构、心肌纤维化和心力衰竭的病理生理过程，特别是miR1、miR21、miR133和miR208是影响心肌重构的关键因素。进一步研究这些miRNA分子所调控的靶基因则有助于发现新的心肌肥厚相关基因。从而加深我们对心肌肥厚过程中复杂的分子病理机制的认识。此外，最近IKEDA等[33]基于miRNA的分类能将心肌样本较准确地区分出四种不同的疾病类型，即非衰竭心脏、缺血性心脏病、扩张型心肌病以及主动脉狭窄，提示miRNA表达谱对于区分和预测临床病因学也具有一定的价值。

　　2.4 心律失常 miRNA可能参与心律失常的病理生理学过程。miR1在人类冠状动脉心脏病以及大鼠心肌梗死模型的心脏组织表达上调，进一步研究发现大鼠正常或梗死心脏过表达miR1可减慢心脏传导，导致心律失常。相反，阻断大鼠梗死心脏miR1功能则会抑制心律失常发生。这些效应可能与钾通道亚单位KCNJ2以及connexin43表达的转录后抑制有关[34]。TERENTYEV等[35]发现大鼠心肌细胞过表达miR1也可通过靶向调节蛋白磷酸酶PP2A的调节亚单位B56α，增加L型及RyR2通道的磷酸化水平，促进钙离子释放和心律失常的发生。这些研究表明miR1水平的严格调控对于维持正常心脏传导至关重要。同时，在心肌梗死后抑制miR1表达可有望减少猝死的发生。ZHAO等[16]发现miR12敲除小鼠具有显著的心脏电传导缺陷，包括心率降低和心室除极缓慢。调节心脏复极化的转录因子Irx5是miR12直接的靶基因，进一步提示miR1在心脏传导中的作用。心肌细胞中miR133过表达可直接转录后抑制ERG(etheragogorelated gene，编码快速延迟整流钾通道Ikr)表达，延长心肌细胞复极化时程[36]。此外，肥厚心肌中miR1和miR133表达下调导致HCN2/HCN4蛋白水平增加[37]，而促进衰竭心脏心律失常的发生。此研究为心力衰竭时心律失常的发生机制提供了新的认识。

　　3 miRNA与血管的病理生理

　　miRNA在调控正常血管发育及血管新生中具有重要作用。Dicer基因敲除小鼠胚胎期血管形成缺陷，血管新生调节因子如VEGF、FLT1、KDR和TIE1等表达异常[38]。内皮细胞是参与血管新生的主要细胞成分。敲低人微血管内皮细胞Dicer会减弱血管新生反应[39]。Dicer通过调控caspase3和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)的表达而影响内皮细胞凋亡[40]，提示miRNA与内皮细胞功能密切相关。进一步研究发现miR221及miR222可通过靶向调节干细胞因子受体ckit或eNOS表达进而抑制内皮细胞迁移、增殖及血管新生[41];let7f通过调控血管新生抑制因子血小板反应蛋白1(thrombospondin1)影响血管新生;miR130a可调节血管内皮细胞同源盒基因GAX和HOXA5表达而促进血管新生[42]。此外，miR27b、miR210及miR126也具有促血管新生的作用。尚有一些miRNA如miR1792基因簇及miR378与肿瘤血管新生相关。研究与血管生成过程密切相关的miRNA将有助于发现新的调节血管新生的方法应用于缺血性疾病如心肌缺血、末梢血管疾病以及糖尿病血管并发症等以及肿瘤的治疗。

　　miRNA也参与炎症过程。miR126可抑制血管内皮细胞细胞黏附分子1(VCAM1)的表达而阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的白细胞黏附[43];炎症因子激活的单核/巨噬细胞中miR155表达也显著上调[44]。这些研究提示miRNA在炎症诱发的血管损伤中可能具有重要作用。由于动脉粥样硬化是一个炎症过程，也间接提示miRNA可能与动脉粥样硬化有关。此外，miRNA也与影响动脉粥样硬化发生的危险因素相关：抑制miR122可显著降低饮食诱发的糖尿病小鼠肝脏脂肪酸和胆固醇的合成速率，降低血浆胆固醇水平，改善肝脏脂肪变性[45]，表明miR122是调节胆固醇和脂肪酸代谢的重要调节因子。研究显示人内皮和血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体3′UTR区的多态性由于与miR155的结合及其后的转录抑制受损而引起血管增厚和动脉粥样硬化发生[46]。这些研究都间接提示miRNA可能与动脉粥样硬化的发生和发展有关。

　　血管重构是血管适应内外环境变化而发生的结构改变。此过程包括血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡的改变以及细胞外基质的变化。血管重构既是生理状况下血管针对长期血流动力学改变的适应性反应，也是高血压和动脉粥样硬化及其介入治疗后发生血管再狭窄的重要病理环节。研究表明大鼠颈动脉损伤后miR21显著上调，利用反义核酸抑制miR21则减少新生内膜的形成。抑制miR21减少平滑肌细胞增殖并增加细胞凋亡，其机制可能与miR21抑制PTEN和增加Bcl2的表达有关[47]。相反，球囊损伤造成血管新生内膜形成时，miR145表达下调，腺病毒介导miR14过表达则可显著抑制内膜新生[48]。近期研究表明损伤的大鼠颈动脉平滑肌细胞miR221和miR222表达上调，它们可能通过调控p27(Kip1)和p57(Kip2)，参与细胞增殖和新生内膜形成[49]。这些研究为miRNA作为血管增殖性疾病的治疗靶点提供了依据。此外，miR221[50]和miR21[51]分别介导血小板衍生生长因子和活性氧信号通路在平滑肌细胞表型改变和损伤中的作用，提示miRNA参与多种信号途径在心血管系统中的效应。

　　总之，目前研究支持miRNA具有重要的血管病理生理学作用。然而，迄今为止人们对于缺氧、炎症以及心血管其他危险因素对于血管中miRNA表达的影响知之甚少，对于血管病理生理过程中miRNA表达的调控及其靶基因的发现将会有助于进一步理解miRNA在血管中的功能。

　　4 展望

　　作为新的特异性基因调节小分子，miRNA不仅有助于阐明心血管基本病理生理过程及相关疾病的发病机制，在心血管疾病的临床诊断和治疗上也无疑将具有重要的应用前景。首先，由于miRNA在不同心血管疾病中的特异表达模式，将有可能以miRNA作为心血管疾病的新的生物标记或诊断指标;其次，由于单个miRNA具有多个mRNA靶点，而多个miRNA又可协同调控某一共同的通路，可以针对疾病的某一特定通路寻找更为有效的干预方法。另外，miRNA是具有细胞渗透性的小分子，体内给药具有可行性。然而，由于疾病过程中可能涉及一系列miRNA，如何选择具有治疗应用的候选miRNA有待进一步研究。因为许多miRNA除了表达于心血管系统，也表达于其他组织。而且，单一miRNA可能调控上百个靶基因，可能会引起所谓的‘脱靶’效应。其治疗上的安全性和副作用也应该谨慎考虑。此外，有人提出采用新的方法，如基因特异性miRNA类似物以及miRNA特异性反义寡聚屏障序列[52]，探索利用miRNA治疗疾病的可能性。综上所述，miRNA在心血管病理生理中发挥着重要的调控作用。miRNA的特异性表达使其可能成为重要的分子标志物，特异性靶基因的发现有助于揭示心血管疾病复杂的分子机制，促进新的治疗方法的产生。然而，由于miRNA数量众多，具有广泛的生物学作用，目前的研究仅是冰山一角。miRNA在心血管系统中还有很多新的作用尚待发现，需要挖掘不同心血管疾病中miRNA的表达模式、调控的靶基因以及参与的信号通路等。计算机分析、生物信息学与心血管细胞生物学、和功能基因组学方法的结合，将有助于推动miRNA在心血管疾病中的研究，并产生心血管疾病预测、诊断及治疗的新方法。

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