非洛地平对oxLDL损伤的人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶mRNA及一氧化氮表达的影响

【摘要】 目的 探讨非洛地平对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA及一氧化氮(NO)表达的影响。方法 将原代细胞分为空白对照组、oxLDL(6、12.5、25mg/L)损伤组、非洛地平(0.1、1.0、10μmol/L)+oxLDL(25mg/L)干预组，采用实时荧光定量PCR技术检测eNOS、iNOS的mRNA水平，硝酸还原酶法测定培养上清中NO的浓度。结果 oxLDL损伤内皮细胞后，eNOS、iNOS mRNA及NO较空白对照组升高;非洛地平下调oxLDL损伤的内皮细胞iNOS的表达，增加其NO的生成。结论 非洛地平可抑制低浓度oxLDL诱导的iNOS mRNA表达，增加NO的生成，发挥其保护内皮细胞的功能。

【关键词】 非洛地平;一氧化氮合酶;一氧化氮;动脉粥样硬化

ABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of felodipine on mRNA levels of endothelial nitricoxide synthase (eNOS) and inducible nitricoxide synthase (iNOS) as well as the level of nitrogen monoxidum (NO) from human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injuryed by oxidized low density lipoprotein (oxLDL). Methods Isolated HUVECs were pided into blank control group， oxLDL injury group treated with oxLDL of different concentrations (6， 12.5 and 25mg/L)， and intervention group of felodipine (0.1， 1.0 and 10μmol/L)+oxLDL (25mg/L). Then eNOS and iNOS expressions were measured by real timepolymerase chain reaction and the level of NO in the supernatants of the cultures was assayed by nitrate reductase method. Results The mRNA expressions of eNOS and iNOS in HUVECs and NO level in the supernatants during treatment with different oxLDL concentrations were higher than those in control group. However， felodipine significantly downregulated the expression of iNOS in HUVECs injured by oxLDL and inceased NO generation. Conclusion Felodipine has protective effects on endothelial cells. The mechanism may be related to its lowering the mRNA expression of iNOS induced by low oxLDL concentration and increasing NO production.

　　KEY WORDS: felodipine; nitricoxide synthase; nitrogen monoxidum; atherosclerosis

　　动脉粥样硬化(atherosclerosis， As)是严重危害人类健康的疾病，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在As的发生、发展中起着重要作用。内源性一氧化氮(NO)主要是由血管内皮细胞在一氧化氮合酶(NOS)的作用下产生的，内皮受损后，NO的合成、释放功能障碍导致内皮依赖性的舒血管反应降低，促进As的形成[1]，其机制涉及NOS的基因调控和活性调节[2]。NOS可分为内皮型(eNOS)和诱生型(iNOS)，eNOS在正常条件下存在于血管内皮细胞中，保证NO的基础释放;生理条件下iNOS蛋白无活性表达，病理状态下产生大量NO引起细胞毒作用，故又称为病理型NOS。近年来，钙通道阻滞剂独立于降压以外的多效作用备受关注，其中抗As作用尤其受到重视。非洛地平(felodipine)是长效二氢吡啶类钙通道阻滞剂，已作为高血压病的首选药物在临床广泛应用。我们前期的研究发现，非洛地平可减轻高脂饮食喂养的兔主动脉粥样硬化病变。本研究试从细胞水平及NOSNO角度进一步探讨其内皮保护作用，为临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 本实验选用原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVEC)，标本来自于西安交通大学医学院第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带放入无菌容器中，3h内行脐静脉内皮细胞的分离培养;置于50mL/L CO2、37℃培养箱中孵育，待原代培养细胞生长至80%～90%融合后进行传代培养;将原代和传至第3代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，进行Ⅷ因子相关抗原的检测;第4代细胞用于实验。

　　1.2 oxLDL的制备 采用一次性密度梯度超速离心法分离LDL。血浆在密度梯度液中，于4℃、50000r/min离心5h;分离出的LDL在4℃的LDL透析液中透析36h，在无EDTA的PBS中4℃透析36h;加入含CuSO4的PBS液，37℃氧化18h，并于4℃避光保存，备用。采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定LDL和oxLDL的纯度，并用硫代巴比妥酸反应法确定其氧化修饰程度。

　　1.3 主要试剂 M199培养基购自GIBCO公司;胎牛血清购自杭州四季青生物研究所;非洛地平原粉、溶剂二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司;总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司;逆转录聚合酶链反应试剂盒为美国Promega公司产品;DNA荧光染料(SYBR GreenⅡ)购自TaKaRa公司;兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物公司;一氧化氮试剂盒购自南京建成生物公司;引物由上海生物工程有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.4 方法

　　1.4.1 细胞培养 取第3代HUVEC于37℃、50mL/L的CO2培养箱孵育、传代、消化，接种在6孔培养板中，观察细胞生长融合约80%后，换成100mL/L胎牛血清的培养液2mL，继续培养24h;应用不同浓度的oxLDL孵育细胞，同时加用不同浓度的非洛地平进行干预。实验分组：①空白对照组：M199培养基与100mL/L胎牛血清;②oxLDL组(As模型)：加入oxLDL 6、12.5、25mg/L培养，各3组，孵育24h;③非洛地平组：0.1、1.0、10μmol/L非洛地平分别与25mg/L oxLDL培养，各3组，孵育24h;④溶剂对照组：DMSO。

　　1.4.2 内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的检测 将原代和传至第3代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待细胞均匀铺满孔底，吸出培养液，用PBS冲洗盖玻片，冷风吹干后-20℃低温冰箱中冻存;加入40g/L多聚甲醛溶液固定30min，PBS冲洗。采用免疫荧光染色：滴加1∶10兔抗人Ⅷ因子抗体血清，再滴加1∶100荧光素标记的羊抗兔免疫荧光抗体，设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片。

　　1.4.3 实时荧光定量PCR检测eNOS、iNOS mRNA的表达 ①RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明书进行提取RNA的操作。所用器皿均用1g/L DEPC水处理，以防止RNA酶污染;②逆转录合成cDNA：按照Promega逆转录聚合酶链反应试剂盒在PCR仪上进行逆转录合成cDNA;③引物的设计与合成：扩增引物序列为：GAPDH正义引物5′CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAG3′，反义引物5′GTGGAATCATATTGGAACATGTAG3′;eNOS正义引物5′GACGCTA

　　CGAGGAGTGGAAGTGGTTC3′，反义引物5′CAG

　　GGCAAGCTGGGATCGGG3′;iNOS正义引物5′AG

　　CAGCATCCACGCCAAGAA3′，反义引物5′GAACAATCCACAACTCGCTCC3′;④实时荧光定量PCR扩增目的基因的反应体系在IQ5型荧光定量PCR仪上进行，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。

　　1.4.4 NO含量的检测 采用硝酸盐还原酶法。NO含量(μmol/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×100μmol/L×1。

　　1.5 统计学处理 全部数据采用SPSS 13.0统计软件分析处理。计量资料数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析法(Oneway ANOVA)检验，以P<0.05为差异有统计学意义。实时荧光定量PCR的数据采用相对定量2-△△CT方法分析处理。

　　2 结 果

　　2.1 HUVEC的培养情况 细胞接种24h后，倒置显微镜下，培养细胞为单层，呈铺路石状镶嵌排列;细胞为扁平多角形，边界清楚，胞质丰富;细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁1～2个(图1)。传代细胞较原代生长旺盛，可见多个双核及核分裂细胞，有时可见多核及巨细胞。

　　图1 倒置显微镜下HUVEC的生长呈铺路石状

　　Fig.1 Morphous of HUVECs under high power lens (×200)

　　2.2 原代及传代HUVEC中Ⅷ因子相关抗原的检测结果 荧光显微镜下可见培养的HUVEC胞质内有黄绿色荧光，证实人Ⅷ因子相关因子的存在(图2)。

　　2.3 不同处理组eNOS、iNOS mRNA的表达情况 各浓度oxLDL均可诱导eNOS、iNOS mRNA表达增加，呈浓度依赖性，以25mg/L oxLDL的作用最为显著，为空白对照组的(2.92±0.74)、(14.95±1.14)倍(P<0.05);iNOS mRNA增加的程度是eNOS的5.12倍。溶剂对照组中DMSO作用不明显(表1)。非洛地平可明显下调25mg/L oxLDL刺激下HUVEC

　　图2 荧光显微镜下HUVEC胞质Ⅷ因子的表达

　　Fig.2 Detection of Ⅷ factor by immunofluorescence (×200)

　　的iNOS mRNA表达，且以0.1μmol/L作用为著，为损伤组的(0.28±0.14)倍(P<0.05);eNOS mRNA变化不明显。iNOS为eNOS的0.19倍(表2)。

　　2.4 不同处理组上清液中NO的含量 oxLDL组均较空白对照组的NO分泌升高(图3A)，呈浓度依赖性，以12.5、25mg/L oxLDL的作用最为显著(P<0.01);0.1、1.0μmol/L的非洛地平增加25mg/L oxLDL刺激下HUVEC上清液NO的分泌，其中1.0μmol/L组有统计学意义，P<0.05(图3B)。数据以2-△△CT表示。与空白对照组比较，*P<0.05。表2 非洛地平对oxLDL损伤HUVEC eNOS、iNOS mRNA表达的影响

　　3 讨 论

　　NO是一个普遍存在的、影响多种生理病理过程的信号分子，具有免疫调节、血压调控和抑制血小板凝聚等生理功能。正常生理情况下，eNOS在细胞内Ca2+浓度较高时才能完全激活，合成小量、短期的NO;当Ca2+浓度减小时，NO量迅速下降，形成一个搏动性的NO释放。eNOS的异常表达与许多病理刺激物有关，外源性刺激物和环境均可调节eNOS mRNA而影响其表达。一些因素如溶血磷脂胆碱、低浓度oxLDL均能增加eNOS的表达。LIAO等[3]首先报道，在人内皮细胞中oxLDL能引起稳态eNOS mRNA和酶活性的时间及浓度依赖性降低，并能导致eNOS mRNA的半衰期从36h减少到10h;低浓度oxLDL作用后出现反常的eNOS mRNA和蛋白表达的增加。在动物模型中，eNOS-/-的小鼠都伴随血管重构、通透性显著降低和凝血异常[47]。最近研究发现，人硬化血管特别是在As高发部位eNOS表达下调[8]，提示血管内皮细胞NO减少导致的血管功能不良是As形成原因之一。近些年来的研究强调了稳态eNOS mRNA对基因整体表达的重要性。本研究发现，低浓度oxLDL作用细胞后eNOS mRNA呈浓度依赖性增加，与先前的文献报道一致。考虑eNOS mRNA水平的升高原因：oxLDL主要组成成分溶血磷脂胆碱的刺激作用;oxLDL可通过增加胞内Ca2+，激活钙依赖性的eNOS，增加NO生成。本实验结果示，1.0μmol/L非洛地平干预后，eNOS mRNA的水平及NO的含量较对照组明显上调;而10μmol/L非洛地平组上清液中NO无明显升高。提示非洛地平阻滞细胞Ca2+通道，影响细胞内Ca2+水平，而eNOS mRNA的稳态密切受到胞内钙离子水平的影响，因此NO生成未见增多。

　　iNOS在静息细胞内几乎不表达，是非Ca2+依赖型，其激活不需要Ca2+浓度升高。当细胞受到刺激，如oxLDL，可诱导iNOS生成。NFκB转录因子是iNOS基因的主要转录调节器，也是免疫和炎症的主要调节因子。文献报道，oxLDL可使细胞内Ca2+迅速升高，其幅度可达基础值的6倍，Ca2+的上升可激活cN端激酶和NFκB，参与细胞的炎症反应等病理生理过程[9]。本实验结果显示，oxLDL可呈浓度依赖性显著上调iNOS的mRNA表达，推测为Ca2+激活NFκB所致;非洛地平干预后可明显下调iNOS的mRNA表达，考虑其可能是通过减少Ca2+的内流、抑制NFκB的激活而实现的。

　　炎症和免疫疾病过程中NO是把双刃剑[10]。不同类型的NOS催化合成的NO会产生不同的生理病理作用。eNOS产生维持生理活性低水平NO(pmol);iNOS产生大量NO(nmol)，产生细胞毒作用。在病理状态下，如内皮受损、缺血、炎症等，生成的NO作为一种氧自由基与核酸、蛋白质及脂质等物质发生氧化还原反应，迅速生成硝基过氧化物，引起细胞毒性和组织损伤[11]。本实验结果显示，在oxLDL作用后，eNOS和iNOS的mRNA表达均上调，同时NO较正常组升高，但以iNOS的升高更为显著，依次为eNOS mRNA的1.59、3.20、5.12倍，故产生的NO可能多为病理性的NO。非洛地平干预后使iNOS mRNA表达下调，为eNOS的0.19、0.31、0.66倍，同时NO的生成增多。提示此时的NO可能为eNOS催化生成，为有益分子，发挥细胞保护作用。

　　综上所述，在As发生、发展的不同阶段，不同NOS催化生成的NO可能是“朋友”，也有可能是“敌人”。非洛地平不仅抑制了oxLDL刺激下iNOS的表达，而且促进了NO的产生，对实验性As具有抑制作用，发挥了保护内皮细胞的作用。本研究为探索非洛地平的抗As机制提供了新思路。

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