哇巴因对大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性及多巴胺D1受体mRNA表达的影响

　　　　　　 作者：张玉蓉，袁祖贻，任延平

【摘要】 目的 观察哇巴因对大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性及多巴胺D1受体mRNA表达的影响。方法 28只SD大鼠随机分为2组，即哇巴因组[27.8μg/(kg·d)哇巴因腹腔注射]和对照组(生理盐水1mL/d腹腔注射)，每周测量鼠尾动脉血压，共5周。于第3、5周后分2批处死动物，应用分光光度法测定各组大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性，同时采用实时定量PCR(realtime PCR)观察肾皮质中多巴胺D1受体mRNA表达的变化。结果 大鼠腹腔注射哇巴因3周后，两组血压无显著性差异，但哇巴因组大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性高于对照组(P<0.01)，多巴胺D1受体mRNA表达低于对照组(P<0.01)。5周后，哇巴因组大鼠血压与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，哇巴因组大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性进一步增高(P<0.01)，多巴胺D1受体mRNA表达进一步减低(P<0.01)。结论 长期小剂量外周注射哇巴因可使SD大鼠血压持续升高，这一作用与肾近曲小管Na+K+ATP酶活性增加引起水钠潴留有关，多巴胺D1受体可能参与了这一过程。

【关键词】 Na+K+ATP酶活性;多巴胺D1受体;哇巴因;高血压;钠转运

　　Medical School of Xian Jiaotong University， Xian 710061， China)ABSTRACT: Objective To study the effects of chronic ouabain treatment on Na+K+ATPase activity and the expression of dopamine D1 receptor in rat kidney cortex. Methods A total of 28 male SpragueDawley (SD) rats were randomly pided into ouabain group and control group， which were treated with ouabain or saline for 5 weeks; rat tail systolic blood pressure (SBP) was recorded weekly. Rats were sacrificed after 3 and 5 weeks， respectively. Then Na+K+ATPase activity and the expression of dopamine D1 receptor in rat kidney cortex were measured by colorimetric assay and realtime PCR， respectively. Results After 3 weeks of ouabain treatment， the mean SBP did not change significantly， but the Na+K+ATPase activity increased (P<0.01) and the expression of dopamine D1 receptor decreased (P<0.01) in comparison with those in control group. After 5 weeks， the mean SBP was significantly higher in ouabain group than in control group (P<0.01); the Na+K+ATPase activity further increased (P<0.01) and the expression of dopamine D1 receptor further decreased (P<0.01). Conclusion Chronic peripheral administration of lowdose ouabain can constantly raise blood pressure of rats， which may be related to the increased renal sodium retention induced by the increased renal cortical Na+K+ATPase activity. Dopamine D1 receptor might be involved in this process.

　　KEY WORDS: Na+K+ATPase activity; dopamine D1 receptor; ouabain; hypertension; sodium handling

　　肾脏是人体负责钠排泄的重要器官，其对水钠排泄的异常是高血压发病机制中的重要环节，其中肾脏近曲小管钠水重吸收增加是高血压形成的主要机制[1]。肾脏近曲小管上皮离子转运非常复杂。但是，近曲小管钠转运的任何改变均伴随着Na+K+ATP酶功能或合成的改变。在肾近曲小管处，Na+K+ATP酶位于上皮细胞基底侧，使肾小管液与胞质之间的Na+维持一定的浓度阶差，为水和钠的重吸收提供了原动力[2]。有研究发现，在某些病理状况下，如果Na+K+ATP酶的活性增强，将明显增加水和钠的重吸收能力，导致机体水钠潴留，血压增高[3]。肾近曲小管能够分泌多巴胺，多巴胺通过多巴胺受体，尤其是D1受体，调节Na+K+ATP酶活性而发挥促进尿钠排泄的作用，当体内钠负荷超载时，肾脏的多巴胺D1受体负责超过50%的钠排泄[4]。

　　内源性哇巴因是一种主要由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，在高血压的发病中起着重要作用。传统观点认为哇巴因升高血压的机制在于哇巴因抑制了细胞膜上的Na+K+ATP酶活性，引起钠离子转运障碍并导致钠离子在细胞内含量增加，继发一系列细胞生物学效应的改变，引起心肌和血管收缩，最终导致血压升高[5]。近年来，越来越多证据表明哇巴因升高血压的作用并不依赖于其对钠泵的抑制[6]。本课题组前期研究中以内源性锂作为肾脏近端小管钠重吸收的标志物证实哇巴因可以使哇巴因高血压鼠肾脏近端小管钠重吸收增加引起水钠潴留，而不是促进尿钠排泄，但其机制尚不清楚[7]。本实验中，以SD大鼠为研究对象，观察哇巴因在升高血压的过程中对肾皮质Na+K+ATP酶活性及多巴胺D1受体表达的影响，探索哇巴因参与肾脏钠转运的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象及分组 180～220g的8周龄雄性SD大鼠(n=28)购自西安交通大学实验动物中心(Ⅰ级动物)，经测量体重、血压后随机分为哇巴因组(n=14)及生理盐水对照组(n=14)。经统计学分析，各组间体重、血压无显著性差异。实验前适应性饲养1周，进行测量血压训练。哇巴因组大鼠首日腹腔注射哇巴因34μg/kg，第2日起腹腔注射哇巴因27.8μg/(kg·d)，共5周。对照组大鼠每日腹腔注射生理盐水1mL。实验过程中各组动物的饲养及生活条件完全相同，各组动物均自由饮水、摄食。

　　1.2 取材 实验3周末，哇巴因组及对照组分别随机抽取7只大鼠，禁食12h后处死，取肾皮质，置于-80℃低温冰箱内保存待测。其余大鼠继续喂养至5周末处死，进行相同检测。

　　1.3 方法

　　1.3.1 血压及体重测定 给药期间每周测量血压、体重各1次。在动物安静状态下测量鼠尾动脉血压，每次测量3遍，取其平均值。收缩压测量采用大鼠尾动脉间接测量法(采用中日友好临床医学研究所研制的RBP1B型大鼠血压计)。

　　1.3.2 肾皮质Na+K+ATP酶活性的检测 将肾皮质按Na+K+ATP酶活性试剂盒(南京建成生物公司)要求操作，用分光光度法进行检测。酶活力单位以每小时毫克蛋白产生的Pi含量表示，即μmol/(mg·h)。

　　1.3.3 实时定量PCR(realtime PCR) 肾皮质总RNA用Trizol试剂(GIBCO BRL， USA)提取，操作按照说明书进行。取2μg总RNA作为模板，以寡聚T作为引物，采用AMV逆转录酶(PROMEGA)合成cDNA，以cDNA作为realtime PCR的模板。所有的实验重复3次。realtime PCR在ABI PRISM 7500 PCR仪(Applied Biosystems， UK)上进行，采用ABI公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix，进行realtime PCR。为确定模板的质量和引物的特异性，在检测样本之前先测定每个模板与其所对应引物的熔解曲线，确保该曲线只有一个峰，且反应产物中只出现1个特异的预期DNA条带。每个样本分别扩增目的基因和内参照基因，并分别设2个复孔。引物如下D1受体：正向引物5′TCTCCTTTCGCATCCTCACG3′;反向引物5′GCCGCACAGACAAGGGTATT3′;GAPDH(看家基因，体系内参照)序列：正向引物5′ACGGGAAACCCATCACCATC3′，反向引物：5′CGCCAGTAGACTCCACGACAT3′。上述引物均由上海生工生物工程公司设计合成。反应体系：SYBR Green Realtime PCR Mix 12.5μL，cDNA 1.5μL，上游引物(10pmol/μL)1μL，下游引物(10pmol/μL)1μL，加水至25μL;反应条件：95℃ 10s，95℃ 5s，60℃ 34s，共50个循环。

　　1.3.4 统计学分析 采用SPSS10.0软件。计量资料数据以均数±标准差表示，组间差异性比较采用t检验，以P<0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 SD大鼠腹腔注射哇巴因后的血压变化情况 实验过程中两组动物在饮食、行为及体重方面无明显差异。两组大鼠摄食量经体重标准化后，无显著性差异(P>0.05)。由于摄入同样的食物，因此摄食量相似意味着钠摄入量亦无显著性差异。实验开始前到哇巴因注射3周时，哇巴因组及对照组血压无显著性差异(P>0.05)。4周后哇巴因组收缩压(SBP)开始上升，5周时与对照组相比有显著性差异(P<0.01，n=7，图1)。

　　2.2 哇巴因组与对照组肾皮质Na+K+ATP酶活性的比较 如图2所示，3周时，哇巴因组大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性显著高于对照组(P<0.01)，5周时，哇巴因组大鼠肾皮质Na+K+ATP酶活性进一步增高(P<0.01)，对照组在各周肾皮质Na+K+ATP酶活性无显著差异(P>0.05)。

　　2.3 肾多巴胺D1受体mRNA水平的变化 SD大鼠腹腔注射哇巴因3周后，大鼠肾皮质D1受体mRNA水平较对照组降低22%(P<0.01)。随着腹腔注射哇巴因时间的延长，D1受体mRNA水平进一步降低，5周时与对照组相比降低27%(P<0.01，图3)。

　　3 讨 论

　　本实验所用的动物模型为本课题组所建立。实验结果显示持续给予哇巴因可使血压维持在较高水平。本研究采用腹腔注射给予哇巴因，操作简便，且哇巴因经腹腔注射后可被稳定吸收。有研究证实，经静脉、皮下、脑室内注入哇巴因均可使非高血压鼠的血压升高[8]。但是，亦有研究发现持续外周注射哇巴因未能引起血压增高[9]。这可能与哇巴因注射部位、时间、药物剂量及试验动物的种属及大小不同有关[10]。

　　Na+K+ATP酶又称钠泵，是在哺乳动物中几乎所有细胞膜上普遍存在的一种特殊蛋白质，在肾脏尤其近曲小管处表达丰富。肾近曲小管可重吸收超滤液中约70%的Na+、Cl、水、100%的葡萄糖和氨基酸。在肾近曲小管，由于上皮细胞基底膜的Na+K+ATP酶的作用，使小管液与胞质之间能够维持一定的Na+浓度差，为水和钠的重吸收提供了原动力[3]。

　　内源性哇巴因是一种主要由下丘脑及肾上腺皮质合成的类固醇激素。近年来的研究发现内源性哇巴因的含量与机体的容量状态和血压的长期调节之间密切相关，提示内源性哇巴因可能是高血压发生、发展的重要发病学因素之一[11]。传统观点认为哇巴因作为钠泵抑制剂，作用于肾小管上皮细胞的基底外侧膜的钠泵，导致细胞内钠离子浓度升高，发挥着利钠利尿的作用。本研究发现哇巴因长期作用的效应并非如此，而是上调了肾近曲小管钠泵的活性。国外有研究表明长期哇巴因干预可引起钠水潴留导致高血压[2]。近期国外亦有研究发现低浓度的哇巴因在体内或与培养的肾小管上皮细胞长期作用后，可使肾小管钠泵的活性及其mRNA和蛋白的表达上调。这些发现似乎与哇巴因作为钠泵抑制剂存在，钠泵活性应是减少而不是增加的现象相矛盾。这可被视为钠泵活性被抑制后，细胞通过正反馈机制来维持细胞内外钠、钾的离子平衡[1213]。因此，哇巴因是钠泵的重要调节因子，可能通过改变近曲小管基底外侧膜上钠泵活性对肾脏近曲小管钠水重吸收产生影响， 进而导致血压的升高。

　　肾脏近曲小管上皮钠转运机制非常复杂，很多蛋白及它们的调节因子都参与了近曲小管的钠水重吸收[3]。肾脏多巴胺是控制钠排泌的一个重要的旁分泌物质，其分泌于肾近曲小管，主要的作用部位也为肾近曲小管。肾脏多巴胺通过多巴胺受体尤其是D1受体发挥促进尿钠排泄的作用， 多巴胺D1受体参与了高血压病理生理变化[4，14]。进一步研究哇巴因与肾脏多巴胺D1受体的关系对于阐明哇巴因对肾脏钠排泄的作用是很有必要的。

　　本实验结果显示自给药第3周起在大鼠血压升高之前，哇巴因组肾皮质D1受体mRNA表达即明显下调，并持续至第5周血压明显升高(P<0.05)。这说明多巴胺D1受体参与了哇巴因升高血压的过程。推测多巴胺D1受体介导的尿钠排泄功能下降可能是哇巴因引起水钠潴留及高血压的机制之一。这将在今后的研究中进一步证实。

　　哇巴因通过何种机制作用于多巴胺D1受体目前尚不清楚。有证据表明哇巴因在心肌细胞、血管平滑肌细胞及肾上皮细胞等部位与钠泵结合后，可使钠泵成为一个细胞信号转导受体，激活细胞内信号转导途径，从而调控大量基因的表达[8]。但是，哇巴因是否通过信号转导途径下调了多巴胺D1受体表达目前尚不明确。本课题组前期研究及国外研究发现长期小剂量腹腔注射哇巴因可以激活肾脏RAS系统，引起循环和组织血管紧张素Ⅱ分泌增加，上调其Ⅰ型受体(AT1)的表达，促进肾小管水钠重吸收[1516]。近年来，有研究报道多巴胺和血管紧张素Ⅱ在调节肾脏尿钠排泄作用中相互拮抗，刺激AT1可下调D1受体表达，抑制其尿钠排泄功能[17]。哇巴因是直接作用下调多巴胺D1受体的表达，还是通过激活肾脏RAS系统，上调AT1受体表达从而下调多巴胺D1受体的表达还有待于今后进一步的研究证实。

　　目前，钠水潴留导致高血压发生发展的确切机制还不明确。哇巴因的发现为该机制的研究提供了一个重要线索或途径。本研究观察了长期小剂量腹腔注射哇巴因可以使SD大鼠血压升高，且在血压升高之前肾皮质钠泵活性及多巴胺D1受体表达均已发生显著变化，结合本课题组前期实验结果，哇巴因高血压鼠血压升高之前肾近曲小管钠重吸收增加，提示钠水潴留可能在哇巴因高血压鼠的发生发展中起重要作用，多巴胺D1受体参与了这个过程。

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