盐负荷对自发性高血压大鼠胸主动脉胶原含量及TGFβ1表达的影响

　　　　作者：卫娜，牟建军，王宝莉，刘富强，黄强，张敏，蒋伟，吴冠吉

【摘要】 目的 动态观察慢性盐负荷对自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉胶原含量及TGFβ1表达的影响，并探讨其可能的机制。方法 80只SHR随机分为2组：4%(质量分数)高盐饮食组(高盐组，n=45)和0.4%(质量分数)正常盐饮食组(对照组，n=35)，持续干预16周。每隔4周监测血压、尿量及尿钠。分别于实验第0、4、8、12、16周时随机分批处死SHR(每次每组6只)，取胸主动脉行Masson染色，观察病理变化并计算主动脉胶原容积分数(CVF)，免疫组化法测定主动脉管壁转化生长因子β1(TGFβ1)的蛋白表达。结果 ①实验第4、8、12、16周，高盐组SHR主动脉CVF均较对照组增高[(8.02±1.21)% vs. (6.87±2.15)%，(10.35±2.07)% vs. (8.21±1.02)%，(16.20±1.58)% vs. (15.31±2.13)%，(19.37±1.816)% vs. (18.7±1.9)%，P<0.05]。②实验第4、8、12周时高盐组SHR主动脉TGFβ1的表达均较对照组增高[(8.02±1.21)% vs. (6.87±2.15)%，(10.35±2.07)% vs. (8.21±1.02)%，(16.20±1.58)% vs. (15.31±2.13)%，P<0.05]。结论 慢性盐负荷可使SHR胸主动脉的胶原含量增加，而局部TGFβ1含量的升高可能是其致胶原含量增加的重要原因之一。

【关键词】 高血压;盐负荷;胶原;转化生长因子β1

　ABSTRACT: Objective To make a dynamic observation on the effect of chronic salt loading on collagen content in thoracic aorta and the expression of TGFβ1 in spontaneously hypertensive rats (SHR) and investigate the possible mechanism. Methods SHRs (80 in number， male， 4-5 weeks old) were assigned randomly to receive 4% (g/kg) high salt (HS groups， n=45) and 0.4% low salt (LS groups， n=35) for 16 weeks. Blood pressure， urine volume and urinary sodium excretion were measured every four weeks. These rats were sacrificed randomly at the start of this study， 4th， 8th， 12th and 16th week， 6 rats in each group each time. The aorta was collected and dyed with Masson to observe the pathological change of thoracic aorta under microscope; microholography system was used to calculate collagen volumetric fraction (CVF) of the aorta. Expression of TGFβ1 in SHR thoracic aorta was measured with immunohistochemical method. Results ① CVF in thoracic aorta was increased significantly in HS group compared with that in LS group at 4th， 8th， 12th and 16th week (P<0.05). ② Compared with that in LS group， the expression of TGFβ1 in HS group was increased at 4th， 8th and 12th week (P<0.05). Conclusion Chronic salt loading can increase collagen content in thoracic aorta of SHR. Local TGFβ1 increase induced by salt loading in SHR is probably involved in the development of collagen increase.

　　KEY WORDS: hypertension; salt loading; collagen; transforming growth factor β1

　　高盐摄入不仅导致血压升高，而且可造成脑卒中、冠心病发病危险增加[1]。临床研究表明，大动脉顺应性减退是心脑血管事件发生的独立危险因素[2]。而近来的研究发现，盐独立于血压之外可直接导致血管重构、硬化和动脉弹性功能下降。本实验动态观察慢性盐负荷对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat， SHR)胸主动脉胶原的影响及其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性4～5周龄SHR 80只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物合格许可证编号SCXK(京)20070001)。普通饲料适应喂养一周后，完全随机法分为0.4%(质量分数)正常盐饲料(对照组，n=35)与4%(质量分数)的高盐饲料(高盐组，n=45)，其他条件一致。分别于实验第0、4、8、12、16周时每组随机选取6只，分批处死。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 血压测量 大鼠35℃预热10min后采用BP6动物无创血压心率测定仪测量大鼠安静、清醒状态下尾动脉收缩压，测量3～4次取均值。每4周监测1次血压。

　　1.2.2 尿量、尿钠观察 于实验第0、4、8、12、16周末用代谢笼收集24h尿液，低速离心后取上清液-20℃冻存备用。采用火焰光度计法测定尿Na+浓度，计算24h尿液Na+排泄量。

　　1.2.3 主动脉胶原染色及分析 100mg/L水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，迅速打开胸腔，经心尖灌注后立即取胸主动脉约1～2cm放入40g/L多聚甲醛中固定，常规脱水、透明，石蜡包埋，而后切片(5μm)行Masson染色。Masson切片中测量胶原容积分数(CVF，为胶原面积与动脉总面积的比值)，每个标本随即选取2～3个视野测量，分别取平均值作为各部位的测量值。

　　1.2.4 免疫组化法检测主动脉TGFβ1表达 石蜡切片脱蜡;水化后加30mL/L过氧化氢，室温孵育20min封闭内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗;热修复抗原;100mL/L正常山羊血清室温孵育10min，消除背景染色;加入适量一抗，工作浓度1∶100，4℃过夜，PBS洗;加生物素标记的二抗(生物素化山羊抗兔IgG抗体)37℃孵育20min，PBS洗;加辣根酶标记的链酶卵白素工作液孵育37℃ 30min，PBS洗;DAB显色，封片。胞质内有棕黄色颗粒为阳性，用Image ProPlus 6.0图像分析系统进行分析，随机选取每张切片5个视野，测定其阳性染色的积分吸光度值(IA)，取5个视野的平均值作为该切片的值。

　　1.3 统计学方法 所有计量资料以均数±标准差(±s)表示，使用SPSS13.0统计软件处理数据。组间比较采用多因素方差分析(Multifactor analysis of variance)。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　〖2〗西安交通大学学报(医学版)〖3〗第31卷

　　4期〖2〗卫 娜，牟建军，王宝莉，等. 盐负荷对自发性高血压大鼠胸主动脉胶原含量及TGFβ1表达的影响

　　2 结 果

　　2.1 尿量与尿钠的变化 基线时两组大鼠尿量、尿钠排泄无差异，实验第4、8、12、16周，高盐组24h尿量及尿钠排泄均高于低盐组(表1)。表1 两组SHR实验各阶段尿量、尿钠的比较与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

　　2.2 实验各阶段血压的变化 多因素方差分析显示高盐、年龄均对血压变化有影响(P<0.01)，高盐饮食组SHR大鼠的SBP在4、8、12、16周等各阶段收缩压均高于对照组(P<0.05，表2)。表2 SHR实验各阶段收缩压的比较与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

　　2.3 主动脉组织形态学的观察结果

　　2.3.1 盐对SHR胸主动脉管壁胶原的影响 随周龄增加两组大鼠的主动脉管壁CVF逐渐增多;实验第4、8、12、16周，与对照组比较，高盐组大鼠主动脉CVF增高(P<0.05，图1、表3)。

　　2.3.2 盐对SHR胸主动脉TGFβ1表达的影响 随周龄增加两组大鼠的主动脉TGFβ1表达逐渐增多，至16周时TGFβ1表达又开始降低。 高盐组与对照组TGFβ1的表达随着周龄趋势一致(图2、表4)。

　　多因素方差分析显示高盐、年龄均对TGFβ1表达水平有影响(P<0.05);高盐组的大鼠在实验第4、8、12周各阶段TGFβ1的表达均较对照组增高，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。

　　A：0周时对照组;B：8周时对照组;C：16周时对照组;D：0周时高盐组;E：8周时高盐组;F：16周时高盐组。染色结果显示胶原纤维呈蓝色，平滑肌细胞及弹性纤维呈红色，胞核为深红色。A：0周时对照组;B：8周时对照组;C：16周时对照组：D：0周时高盐组;E：8周时高盐组;F：16周时高盐组。图中的棕黄色颗粒为TGFβ1表达。表3 实验各阶段SHR大鼠CVF的比较与对照组比较，*P<0.01。表4 各组SHR大鼠胸主动脉壁TGFβ1的吸光度值与对照组比较，*P<0.01。

　　3 讨 论

　　近年来，对高血压的认识从阻力动脉转向对大动脉的重视。研究表明大动脉顺应性的降低是高血压发生发展和各种并发症发生的重要原因[3]。大动脉顺应性降低的主要原因是动脉壁结构的变化，包括血管平滑肌细胞增殖，胶原增生，弹性纤维减少或断裂，导致大动脉僵硬度增加，弹性降低等。胶原是细胞外基质的主要组分，除了作为血管壁的支撑材料外，还可以影响血管壁的组织形态。

　　盐与心血管疾病的发生关系密切。高盐摄入不仅导致血压升高，而且有独立于血压之外的多重作用，可直接导致组织器官损伤，如左室肥厚、肾功能损害、脑卒中、血管硬化等[45]。本实验研究结果显示，实验第4、8、12、16周时，与正常盐组比较高盐组主动脉CVF增加，提示盐可通过增加大动脉的胶原含量从而降低其顺应性。人群实验也显示，适量低盐饮食可以降低血压、尿蛋白及动脉僵硬度[6]。SIMON等[7]的研究发现，高盐摄入在不影响血压的情况下能使大动脉的结构和血管壁性能发生改变，并认为盐能独立于血压对大动脉血管壁结构和功能产生影响。AVOLIO等人调查了年龄、血压匹配的血压正常人在低盐和正常盐饮食不同状态下的脉搏波传导速度后发现，低盐组的主动脉、上下肢的脉搏波传导速度明显低于正常盐饮食组。这个研究证实血压正常人低盐饮食时大动脉的僵硬度较低。SAFER等[89]研究证明，给高血压患者及高血压大鼠增加钠摄入量时多伴有大动脉结构和功能的改变。这种改变涉及到细胞外基质，但与血压及动脉粥样硬化无关。本实验室前期的研究结果也显示，高盐摄入可以使动脉弹性降低，盐对大动脉动脉壁的功能影响早于小动脉。

　　盐通过什么机制作用于动脉壁，进而导致动脉弹性降低，目前尚不清楚。近年来，随着对TGFβ的深入研究，发现它对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、成纤维细胞增生、细胞外基质沉积以及介导心血管疾病的发生起着重要作用。新近研究发现在众多细胞生长因子中，TGFβ1基因变异与高血压及其靶器官损害的关系非常密切[10]。有研究发现，自发性高血压大鼠在心室重塑过程中TGFβ1蛋白表达明显增高。TGFβ1增强细胞外基质合成并诱导血管平滑肌细胞肥大、成纤维细胞增生和成纤维细胞向肌成纤维细胞表型的转化。在本实验中高盐组的大鼠在实验第4、8、12周时TGFβ1的表达均较正常组增高，提示盐促进主动脉胶原增加以及加重动脉重构可能部分是通过增加TGFβ1的表达而实现的。实验结果还显示，TGFβ1在高盐组与正常组的表达趋势一致：第0周时表达较少，第4周时表达增多，第8周时TGFβ1的表达最多，而第12、16周时TGFβ1表达又逐渐降低，分析原因可能与实验后期主动脉管壁的细胞外基质增加而内皮细胞、血管平滑肌细胞等合成TGFβ1的物质减少有关。这也提示主动脉重构并不完全是通过由盐引起的TGFβ1的增加而引起，血压及年龄等也是影响动脉胶原含量及重构的重要原因。

　　本实验研究结果提示高盐摄入不仅可使血压升高，还可通过影响TGFβ1的含量进而导致动脉僵硬。所以，更应进一步强调限盐的重要性，提倡及早开展以限盐为中心的高血压一级预防。

参考文献

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