甲型副伤寒特异性转移因子的制备和检定

　　　　作者：周建伟，罗军敏，孙万邦，马锐，田丹

【摘要】 目的 初步制备甲型副伤寒特异性转移因子(PASTF)，为临床提供紧急预防或辅助治疗甲型副伤寒的新型生物制剂。方法 体内免疫法制备PASTF，采用紫外分光光度计对PASTF进行多波长扫描，以苔黑酚法和改良Lowry法分别检测PASTF的核糖及多肽含量，并进行无菌试验、热原质试验和安全试验等，以免疫保护性试验检定其免疫学活性。结果 PASTF的理化性状符合《中国生物制品》(2000版)的要求标准;免疫保护性试验中，灌服PASTF的小鼠存活率均明显高于灌服nTF和NS的小鼠的存活率(P<0.05)。结论 成功制备了PASTF，该制剂可转移针对甲型副伤寒沙门菌的特异性免疫应答，增强小鼠抗甲型副伤寒沙门菌的免疫力。

【关键词】 甲型副伤寒;特异性转移因子;制备;检定

　　ABSTRACT: Objective To prepare a new kind of biological agent initially， which will be used for emergent prevention or adjuvant therapy for paratyphia.Methods Paratyphia specific factor (PASTF) was prepared in vivo and scanned with multiwavelength using ultraviolet spectrophotometer. Then we determined the content of polypeptide and ribose with orcinol assay and modified Lowry assay respectively， followed by sterility test， pyrogen test and safety test. The immunological activity was assayed by immune protection test.Results The physicochemical properties of PASTF accorded with the criteria of Chinese Bioproduct Rules (2000 edition). In the immune protection test， the survival rate of mice was higher in the two experiment groups than in control group and NS group (P<0.05).Conclusion PASTF has been prepared successfully in vivo. It can transfer the specific immune response aiming at salmonella paratyphi a (SPA) and enhance the specific antiSPA immune effect.

　　KEY WORDS: paratyphi a; specific transfer factor; preparation; standardization

　　甲型副伤寒是由甲型副伤寒沙门菌引起的急性消化道疾病，其发病率在亚洲范围内呈逐年上升的趋势[13]，我国贵州省就属于高发区。该病由于缺乏有效的疫苗，耐药菌株不断增多，耐药菌谱不断扩大，所以其防治日趋迫切。

　　特异性转移因子(specific transfer factor， STF)是采用某种特定病原免疫动物，取其免疫器官或外周血白细胞制备的具有该抗原特异活性的小分子物质，无种属特异性，无免疫原性。本研究拟采用体内免疫法制备甲型副伤寒特异性转移因子(paratyphi a specific transfer factor， PASTF)，旨在为临床紧急预防或辅助治疗甲型副伤寒提供一种新型生物制剂。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康成年山羊5只，体重30～40kg，由遵义医学院动物实验中心提供;昆明小鼠120只，SPF级，雌雄各半，体重18～22g，购自重庆市中药研究所实验动物研究室。

　　1.2 主要试剂及仪器 甲型副伤寒沙门菌(ATCC50001)由中国医学菌种保藏保管中心提供;弗氏完全佐剂为美国Sigma公司产品;植物血凝素(PHA)由广州市医药工业研究所提供;6405UV紫外分光光度计为英国Jenway公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物免疫 以灭活的甲型副伤寒沙门菌液免疫山羊，首次加适量弗氏完全佐剂，每次免疫间隔1周;第4次免疫完后抽血测定抗体效价，达到

　　1∶2560，1周后腹腔加强免疫1次;10d后处死，取脾脏存于-20℃冰箱备用。

　　1.3.2 PASTF的制备 取免疫的山羊脾脏，剪去筋膜和大血管，用无菌生理盐水冲洗，剪碎，低温匀浆后以超声细胞粉碎仪破碎，-20℃冷冻，37℃水浴融解，连续冻融4次，装入透析袋中透析，收集透析液，过滤除菌，分装备用。

　　1.3.3 非特异性转移因子(nonspecific transfer factor， nTF)的制备 取健康成年山羊的脾脏，与PASTF同样的方法制备nTF。

　　1.4 理化性状的检定 采用紫外分光光度计对PASTF进行多波长扫描，以苔黑酚法和改良Lowry法分别检测PASTF的核糖及多肽含量，并进行无菌试验、热原质试验和安全试验等。

　　1.5 特异性免疫活性检测

　　1.5.1 确定半数致死量(LD50) 取昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，分别以不同浓度菌液的甲型副伤寒沙门菌进行腹腔注射，每只0.5mL，观察4d存活率，计算LD50。

　　1.5.2 攻击试验 取昆明小鼠60只，雌雄各半，随机分成NS组、实验组、对照组，每组20只。分别以生理盐水、PASTF、nTF灌胃，每只1mL，连续7d，第9天用LD50量的甲型副伤寒沙门菌液腹腔攻击1次，观察4d存活率。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件处理数据。计量资料以±s表示，组间比较用t检验，单因素计数资料比较用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 理化性状

　　2.1.1 PASTF的多波长扫描 PASTF和nTF经多波长扫描后显示，均在波长252～262nm处有一最大吸收峰(图1)。

　　2.1.2 理化指标检测 PASTF的理化指标均符合《中国生物制品规程》(2000版)的要求标准，且两者比较无统计学差异(表1)。

　　2.2 特异性免疫活性 根据不同浓度甲型副伤寒沙门菌所致小鼠死亡率(表2)，用寇氏法计算LD50为0.82×109 CFU。用1.64×109CFU的甲型副伤寒沙门菌菌液给5组试验小鼠腹腔注射，各组存活率见表3。表1 体内法制备的PASTF、nTF的理化性状的比较表2 不同浓度菌液所致小鼠死亡率的比较表3 各组小鼠生存率的比较

　　3 讨 论

　　STF是近年来研制的一种具有免疫调节功能的免疫佐剂。虽然其发挥免疫调节功能的机制尚不清楚，但诸多基础和临床应用研究业已证实，STF在预防及辅助治疗细菌[4]、病毒[5]等病原感染和肿瘤[6]方面具有较好的效果。目前，针对甲型副伤寒沙门菌感染的特异性转移因子的研究，国内外文献尚未见报道。

　　本研究采用体内免疫法制备PASTF，其理化性状符合《中国生物制品规程》(2000版)的要求标准，与普通转移因子比较，其多肽、核糖等理化指标没有显著差异。两种转移因子多波长扫描图相似，均在波长252～262nm处有一最大吸收峰，在300nm处A值接近零。我们把最大扫描波长扩大到450nm，发现PASTF及nTF在380～390nm处均又出现一个小的吸收峰。那么，什么成分形成了这个吸收峰呢?这些成分在STF或nTF生物学活性中的作用又是怎样的呢?这些问题有待进一步的研究。

　　免疫保护性实验结果显示，PASTF与nTF对甲型副伤寒沙门菌攻击小鼠均有一定的保护作用。但是，灌服PASTF的小鼠的存活率显著高于灌服nTF的小鼠(P<0.05)。说明PASTF可以转移针对甲型副伤寒沙门菌的特异性免疫应答，增强小鼠抗甲型副伤寒沙门菌的特异性免疫效应。由于PASTF与nTF在理化指标上没有显著差异，所以它们这种免疫活性的差异可能是由于不同的空间结构造成的。本研究通过成功制备PASTF，为甲型副伤寒的防治提供了一种新的思路，为以后PASTF在临床的应用提供了实验依据。

参考文献

　[1]闫梅英，梁未丽，李伟，等. 1995～2004年全国伤寒(副伤寒)的流行分析 [J]. 疾病监测， 2005， 20(8):401403.

　　[2]胡春晓，杨春莲. 贵州六枝特区甲型副伤寒爆发流行的治疗体会 [J]. 现代医药卫生， 2007， 23(9):13651366.

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　　[5]石伟珍，过建军，施军平，等. 抗乙肝胎盘转移因子治疗乙型肝炎肝硬化疗效观察 [J]. 医学研究杂志， 2008， 37(3):6070.

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