siRNA沉默Annexin1 基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响

　　　　作者：高琳 杨远航1 徐万海 林相国 李建章 杨德君 王晓民

【摘要】 目的 观察RNA 干扰技术沉默Annexin1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响。方法 针对Annexin1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(siRNA)，脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞，转染后应用半定量RTPCR和Western印迹法检测Annexin1 mRNA和蛋白的改变，透射电镜观察细胞凋亡情况，用MTT法检测沉默Annexin1表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响。结果 转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA和蛋白水平显著下降(P&<0.05)，转染siRNA沉默Annexin1基因表达后膀胱癌T24细胞出现典型凋亡细胞，增殖能力显著下降(P&<0.05)。结论 RNA 干扰Annexin1基因后其mRNA 和蛋白水平显著下降，诱导了膀胱癌T24细胞凋亡，并且抑制细胞的增殖。

【关键词】 膀胱癌;Annexin1;siRNA

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin1 gene were designed， synthesized， and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection， expression of Annexin1 was detected by RTPCR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was evaluated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNANC) groups， transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin1 mRNA and protein. Annexin1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin1 could effectively reduce the expression of Annexin1 gene， reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.

　　【Key words】 Bladder cancer; Annexin1; siRNA

　 膜联蛋白1(Annexin1)增强感染局部的凋亡表明它对肿瘤的诊断和治疗有重要意义，因此该蛋白质与肿瘤细胞的活性调节相关〔1，2〕。目前，Annexin1的表达缺失是否与膀胱癌细胞的异常增殖潜力相关以及对化疗药物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干扰(RNAi)技术通过沉默Annexin1基因直接观察Annexin1表达缺失对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响，为进一步揭示该基因促进肿瘤进展的机制提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 膀胱癌T24细胞株(哈尔滨医科大学附属第四医院中心实验室提供)，RNA干扰试剂盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV购自Invitrogen 生命技术公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶购自GIBCO公司。

　　1.2 小干扰RNA(siRNA)的设计及合成 根据GenBank 中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA设计原则，应用Ambion生物公司的设计软件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，记下其3′端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选序列在GenBank中用Blast软件进行同源序列搜索，排除那些和其他基因编码序列或EST同源的候选序列。最终选择了3段21个碱基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分别靶向Annexin1基因的240260 (SI) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)区域(见表1)。另外，根据转染后细胞形态学变化，设计与TI(240siRNA)序列含有同样核苷酸比例的随机对照siRNA(240c1，240c2)做为阴性对照，用Blast验证随机序列与GenBank中其他已知人类基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(βactin)基因的正、反义寡核苷酸模板作为RNA干扰实验的阳性对照。设计的正反义寡核苷酸模板3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.3 引物的设计与合成 设计1对Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′，下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，长度 546 bp，同时设计1对管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，长度290 bp，由上海生工合成。

　　1.4 细胞培养 常规RPMI1640培养，至转染前夜，细胞培养液更换为用无血清和无抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱，转染后用20%FBS IMDM培养液，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。用OptiMEMⅠ转染液及脂质体LipofectamineTM 2000转染试剂，按试剂盒说明优化转染条件，分别将3对siRNA和阳性对照筛选出的干扰序列的scramble siRNA(siRNAneg)以400 nmol/L的终浓度加入细胞培养液，孵育24、48、72 h后收获细胞进行检测。实验重复3次。表1 靶向Annexin1的siRNA核苷酸序列

　　1.5 半定量RTPCR检测转染前后膀胱癌T24 细胞Annexin1 mRNA 的表达水平 Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用2 μg总RNA进行cDNA的合成，半定量RTPCR方法检测siRNA转染后不同时间点24、48、72 h细胞中Annexin1 mRNA表达水平，βactin作内对照。PCR 扩增条件Annexin1：95℃预变性5 min;94℃变性40 s，58℃复性1 min，72℃延伸1 min，共33个循环;72℃延伸10 min。βactin：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环;72℃延伸10 min。取适量PCR扩增产物，在2%琼脂糖凝胶电泳(80 V，25 min)，EB染色，紫外灯下观察结果并拍照。

　　1.6 Western印迹法检测转染前后膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白的表达 取状态良好对数生长期细胞5×106个，用PBS洗2遍，于冰上加冷的细胞裂解液，制备细胞总蛋白，Lowry法蛋白定量。将样品置于5×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热10 min使蛋白质变性，丙烯酰胺凝胶电泳，Western印迹法，按0.1 ml/cm2的量加入封闭液和适量稀释的抗体，于摇床上室温2 h，PBS漂洗滤膜3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，将漂洗过的硝酸纤维素膜移至上述底物溶液中，轻轻摇动，蛋白条带的颜色达到要求，即用水冲洗，滤纸吸干，拍照，保存。内参对照使用小鼠抗人βactin(稀释度为1∶10 000)。

　　1.7 siRNA和脂质体的细胞毒性检测 细胞用无血清和无抗生素的培养液洗涤重悬，每孔2×104加入96孔板。分别加入用OptiMEMⅠ稀释的siRNA(终浓度为100 nmol/L)或Lipofectamine2000(终浓度为2 ml/L)，6 h后加入含20%血清的培养液补足血清，72 h后分别加入5 mg/ml的MTT，每孔20 μl，37℃置4 h，弃上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜，待甲瓒完全溶解后，测定其在570 nm的吸光度，并计算细胞存活率。对照孔细胞中加入等量的OptiMEMⅠ代替脂质体或siRNA，其余培养条件与处理组相同。存活率(%)=(处理孔OD570-空白孔OD570)/(对照孔OD570-空白孔OD570)×100%。

　　1.8 透射电镜观察细胞凋亡形态 取细胞1×107个，冷PBS洗3遍，预冷2%戊二醛于4℃固定细胞2 h，冷PBS洗3遍，1%四氧化锇酸4℃再固定30 min，常规电镜脱水、包埋并超薄切片，用醋酸双氧铀和铅染液双重染色，观察细胞超微结构。

　　1.9 MTT法检测细胞增殖能力的改变 对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔接种1×105个细胞，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后换用无血清的培养基。实验组设7个不同药物浓度，按相同倍数递增。每组药物浓度设6个复孔，对照组不加药物，继续培养24～96 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)孵育4 h后吸弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡溶解10 min，酶联免疫检测仪490 nm波长测吸光度值(A)，细胞增殖抑制率计算公式为：抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A均数)×100%，绘制生长曲线，重复3次。

　　1.10 统计学处理 应用SPSS11.0软件对数据进行统计分析，数据结果以x±s表示，两组均数间比较采用双尾Student′s t检验，多组均数间比较采用方差分析(ANOVA)。

　　2 结 果

　　2.1 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA表达的影响 经AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)软件分析，以40 nmol/L浓度转染T24细胞24 h后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组mRNA表达水平明显降低(图1)，在24 h下调(80.63±0.24)%(t=474.3，P=0.001);在48 h下调(38.9±0.85)%(t=64.833，P=0.01)，72 h恢复正常。

　　2.2 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白表达的影响 与随机对照相比，靶向Annexin1的siRNA转染后细胞内Annexin1蛋白表达明显下降，与RTPCR结果一致。见图2。

　　1：Marker DL200，2：siRNA 转染24 h，3：siRNA转染48 h，4：siRNA 转染72 h，5：siRNA阴性对照，6：未转染组

　　图1 siRNA对膀胱癌T24细胞

　　Annexin1 mRNA表达的影响

　　2.3 沉默Annexin1基因对T24细胞增殖能力的影响 转染siRNA Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ序列靶向降低Annexin1基因表达后T24细胞的体外增殖能力明显降低(图3)，以未转染的细胞做对照，转染siRNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别是siRNA I：0.98/0.73/0.49倍，siRNA Ⅱ：0.97/0.65/0.41倍，siRNA Ⅲ：0.91/0.55/0.39倍，其中48、72 h组差异有统计学意义。

　　图2 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白表达的影响图3 沉默Annexin1基因对T24细胞增殖能力的影响

　　2.4 细胞凋亡的形态学观察 对照组肿瘤细胞未发生凋亡，细胞核形态正常，核内异染色质未发生固缩现象，核仁清楚;细胞质中原生质着色均匀;线粒体结构完整;嵴无断裂(图4a)。经过siRNA作用48 h后的T24细胞出现典型凋亡细胞特征(图4b)，凋亡小体形成;异染色质已发生固缩，核仁消失;细胞质中出现空泡;原生质着色不均匀;线粒体扩张;嵴肿胀、断裂。

　　图4 siRNA作用前后的T24细胞

　　2.5 siRNA和脂质体的细胞毒性检测结果 T24细胞经靶向Annexin1基因的siRNA或oligo Lipofectamine处理后计算细胞存活率，与未处理的T24细胞相比，没有显著统计学差异，显示siRNA及脂质体本身在实验条件下对细胞基本没有毒性作用。

　　3 讨 论

　　RNAi是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其沉默的过程，是一种典型的转录后基因调控方法，此时启动子是活跃的，靶基因能够被转录，但不能正常累积mRNA。其优点首先表现在siRNA只引起与其同源的mRNA降解，而其他基因的表达不受影响，因此具有高度的序列专一性。许多实验证实，导入细胞的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关基因不受影响〔3〕。在siRNA序列中配对的19～21nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有明显的特异性。其次RNAi是通过自身放大机制来发挥作用，极少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表达，因此与反义寡核苷酸等基因封闭技术相比，具有高效性〔4〕。另外RNAi操作简便快捷，利用RNA干扰技术，甚至可以在一周之内可以关闭10个基因。

　　2001年，Elbashir等首次报道siRNA在哺乳动物体外培养细胞中能够成功的诱导特异基因受阻〔5〕。作为一种有效抑制基因表达的方法，RNA干扰技术在近几年被广泛用于基因的功能研究。双链siRNA的合成是进行RNAi研究的关键〔6〕，本研究采取体外转录法，即在噬菌体RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下，以连有噬菌体启动子的线性DNA为模板，直接合成出特异双链siRNA。RNA聚合酶是体外转录合成siRNA的关键酶，除了本实验中用到的T7 RNA聚合酶，其他通用的RNA聚合酶还有T3、SP6 RNA聚合酶，它们均是以DNA为模板的RNA聚合酶。DNA模板必须连有特异的启动子序列，启动子区域是噬菌体RNA聚合酶结合和RNA开始合成的部位，因此本实验在设计寡核苷酸模板的时候，3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′。在RNA聚合酶结合到双链DNA启动子后，聚合酶分开双链DNA模板，并以3′5′链作为模板合成出互补的5′3′RNA链，合成出的正反义RNA链经杂交即可得双链RNA。在本研究中，以AA开头针对597 bp的Annexin1 cds区的靶序列共有26个，其中GC碱基含量在50%以下的有25个，对其进行Blast分析，最终选择了240260 (SI)，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)的3段序列，其中SI SiRNA靶序列的GC含量为43.9%，SⅡ SiRNA靶序列的GC含量为39.2%，SⅢ SiRNA靶序列的GC含量为41.2%。结果表明3段siRNA序列都有抑制Annexin1基因表达的作用，但是SⅡ siRNA抑制作用要更强一些。通过研究3对不同的靶向干扰序列和1对阴性对照序列，发现在mRNA水平3对靶向序列均可抑制Annexin1的表达，在蛋白水平也获得较高的抑制效果。MTT结果发现，与未转染细胞或转染阴性对照细胞相比，转染siRNA可显著抑制T24细胞的生长，增加G0/G1期比例，诱导肿瘤细胞凋亡，与Mariotti〔7〕报道一致。总之，本研究通过siRNA下调Annexin1基因表达，导致细胞周期发生改变使细胞增殖缓慢和凋亡，为Annexin1与膀胱癌临床相关性和治疗新途径提供了实验依据。

参考文献

　1 SilistinoSouza R，RodriguesLisoni FC，Cury PM，et al.Annexin 1：differential expression in tumor and mast cells in human larynx cancer〔J〕. Int J Cancer，2007;120(12):25829.

　　2 Ang EZ，Nguyen HT，Sim HL，et al.Annexin1 regulates growth arrest induced by high levels of estrogen in MCF7 breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2009;7(2):26674.

　　3 Dalzell JJ，McMaster S，Fleming CC，et al.Short interfering RNAmediated gene silencing in Globodera pallida and Meloidogyne incognita infective stage juveniles〔J〕.Int J Parasitol，2010;40(1):91100.

　　4 PalBhadra M，Bhadra U，Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell，2002;9(2):31527.

　　5 Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836)：4948.

　　6 Berezhna SY，Supekova L，Supek F，et al.SiRNA in human cells selectively localizes to target RNA sites〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103(20):76827.

　　7 Mariotti M，Castiglioni S，Maier JA.Inhibition of T24 human bladder carcinoma cell migration by RNA interference suppressing the expression of HDPTP〔J〕.Cancer Lett，2009;273(1):15563.