血管内皮生长因子及其受体在子宫内膜癌中的表达及对淋巴管生成的作用

【摘要】 目的 检测子宫内膜癌中血管内皮生长因子(VEGF)D及其受体VEGFR3表达，探讨其在子宫内膜癌淋巴管新生中的价值。方法 选择120例子宫内膜癌存档的蜡块作为观察组，60例正常增生期子宫内膜蜡块作为对照组，应用免疫组织化学技术检测VEGFD、VEGFR3及淋巴管内皮透明质酸受体(LYVE)1的表达，探讨其临床意义及在淋巴管生成中的价值。结果 VEGFD、VEGFR3在子宫内膜癌中表达的阳性率明显高于对照组，LYVE1标记的淋巴管密度明显高于对照组(P&<0.05)，VEGFD、VEGFR3及LMVD与子宫内膜癌的浸润深度及淋巴结转移密切相关，肿瘤中VEGFD与VEGFR3、VEGFD与LMVD、VEGFR3与LMVD均呈正相关。结论 子宫内膜癌中VEGFD及VEGFR3高表达，并具有协同作用，促进LYVE1阳性淋巴管生成，联合检测VEGFD、VEGFR3及LYVE1可能有助于判断子宫内膜癌的预后。

【关键词】 子宫内膜癌;淋巴管;VEGFD;VEGFR3;LYVE1;免疫组织化学技术

　 近年认为血管内皮生长因子 (VEGF)D可以促进淋巴管生成，介导肿瘤的淋巴道播散。研究显示VEGFD常通过VEGF受体 (VEGFR)3发挥作用〔1〕。淋巴管内皮透明质酸受体1(Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor1，LYVE1)是近来发现的淋巴管内皮细胞及巨噬细胞表面特异性膜蛋白，为LYVE特异性受体，标记淋巴管的特异性强。本文应用免疫组织化学技术观察子宫内膜癌中VEGFD、VEGFR3及LYVE1的表达，探讨其相关性及临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 我院2006年1月至2007年12月经病理确诊的子宫内膜癌术后存档蜡块，共120例，患者年龄40～78(平均58.2)岁。手术前均未进行任何治疗。收集60例确诊为增生期子宫内膜的存档蜡块作为对照组。

　　1.2 免疫组化方法检测VEGFD、VEGFR3及LYVE1的表达 VEGFD、VEGFR3及LYVE1均购自武汉博士德生物技术有限公司，应用免疫组化SP法进行检测，具体步骤：①常规脱蜡水化后，用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复及EDTA抗原热修复。②滴加过氧化物阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性。③滴加非免疫性动物血清阻断非特异性反应。④滴加第一抗体，4℃过夜。⑤滴加生物素标记的第二抗体。⑥滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液。⑦滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min，阳性显色为棕色，以上各步之间均用PBS浸洗3次，每次5 min。⑧自来水冲洗终止染色，苏木素复染，0.1%盐酸分化，PBS冲洗返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

　　1.3 结果判定标准 免疫组化染色结果：LYVE1标记的淋巴管计数参照Weidner〔2〕方法进行微淋巴管计数，即先在低倍镜(100×)下观察癌及正常黏膜组织中最丰富区，然后在高倍镜(400×)下计数，每个阳性染色的内皮细胞、内皮细胞簇或单个小脉管均视作1个微淋巴管(如管径超过8个红细胞不计为微淋巴管)。每例计数4个视野，取其平均值计为微淋巴管密度(MLVD)。VEGFD和VEGFR3阳性表达于上皮细胞胞质内，为浅黄色至棕褐色颗粒，每张切片计数10个高倍视野，计算阳性细胞占总细胞数的百分率大于25%为阳性表达。

　　1.4 统计学方法 应用SPSS统计学软件，两组间比较采用χ2检验或t检验，并进行线性相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 VEGFD、VEGFR3及LYVE1在子宫内膜癌、增生期子宫内膜组织的表达 子宫内膜癌中VEGFD〔65.83%(79/120)〕、VEGFR3表达阳性率〔74.17%(89/120)〕明显高于增生期子宫内膜中表达阳性率〔35.00%(21/60)、26.67%(16/60)〕，子宫内膜癌中LYVE1标记的LMVD(15.70±4.47)明显高于增生期子宫内膜(8.92±3.69)(均P&<0.000 1)。

　　2.2 VEGFD、VEGFR3及LMVD的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系 VEGFD、VEGFR3表达阳性率及LMVD在不同浸润深度及淋巴结转移差别显著(P&<0.05)，见表1。表1 VEGFD、VEGFR3及LMVD表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系

　　2.3 子宫内膜癌中VEGFD、VEGFR3与LMVD表达的关系 经线性相关分析，子宫内膜癌中VEGFD与VEGFR3(r=0.51，P=0.003 2)、VEGFD与LMVD(r=0.47，P=0.009 7)、VEGFR3与LMVD(r=0.45，P=0.015 9)均呈正相关。

　　3 讨 论

　　肿瘤发生发展过程中，淋巴管生成是肿瘤发生淋巴道转移的重要基础，研究淋巴管生成的机制是研究肿瘤转移的重要途径，目前的研究多集中于淋巴管生长因子及其受体表达上，而VEGFR3被认为是淋巴管生长因子的受体〔3〕，VEGFD/VEGFR3信号传导途径诱导肿瘤淋巴管生成的功能为人们了解淋巴系统的功能提供了新机会〔4〕。VEGFD与VEGFR3结合引起VEGFR3同源或异源二聚化，分泌后的VEGFR3经过糖基化和蛋白水解，形成保留碳端的成熟型。VEGFD经水解掉N、C端后，形成二聚体并与之作用，两个VEGFR3L或VEGFR3S单体分别通过第Ⅳ免疫球蛋白样区结合形成同源二聚体。LYVE1作为一种淋巴管系统特殊标志物，不仅标记的特异性强，而且能够提供淋巴管生成的信息〔5〕。有研究认为其只表达于淋巴管，均匀分布于淋巴管的基底面和胞腔面〔6〕。

　　本文结果提示VEGFD、VEGFR3与LYVE1在子宫内膜癌的发生中具有促进作用。LYVE1标记的淋巴管内皮细胞呈棕黄色，切片背景清晰，可以见到淋巴管内皮细胞膜和细胞质染成淡黄或棕褐色，肿瘤实质内淋巴管多形成分枝状。本实验结果提示VEGFD、VEGFR3与LYVE1具有协同作用，也提示VEGFD、VEGFR3的相互作用，激活LYVE1阳性的淋巴管新生。VEGFD主要通过激活VEGFR3途径来促进淋巴管新生和肿瘤转移，具体机制可能为：①增加浸润肿瘤细胞的表面积，促进淋巴内皮的增生;②增加通透性或改变淋巴内皮细胞间的黏着力或改变淋巴内皮的某些化学因子、细胞因子的表达;③改变组织间液的压力，增加血管间隙，组织淋巴液增加是肿瘤细胞进入脉管循环的决定因素;④可能通过刺激NO产生而调节淋巴管舒缩，增加淋巴管通透性，并促进淋巴液经周期性收缩作用而扩散至淋巴结。本实验对临床病理特征分析发现，VEGFD、VEGFR3与LYVE1的表达量与浸润深度及淋巴结转移相关，提示三者参与了肿瘤的发展。由于子宫内膜癌的浸润深度及淋巴结转移均为与患者预后相关的重要因素，因此，术后检测VEGFD、VEGFR3与LYVE1在子宫内膜癌中的表达，可能对判断预后有一定价值。

参考文献

　1 李 健，沈 琳.胃癌组织中VEGFC与VEGFD及受体3的表达及其临床病理意义的研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2008;15(7)：5147.

　　2 Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors〔J〕. Breast Cancer Res Treat，1996;36：16980.

　　3 刘爱东，王献华，庞久玲.大肠癌血管内皮生长因子C及酷氨酸激酶受体4的表达与淋巴管生成及其转移的关系〔J〕.华北煤炭医学院学报，2006;8(5)：5924.

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　　5 郅克谦，高 岭，赵 璐，等.LYVE1表达对舌癌淋巴结转移影响的研究〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2010;31(2)：25860.

　　6 杨守华，程恒辉，王泽华.LYVE1和D240在检测早期宫颈鳞状细胞癌和癌前病变微淋巴管中的研究〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2008;17(6)：28893.