【摘要】 目的:研究含重复序列(GAA)n·(TTC)n的菌体在传代培养中氨苄青霉素对其遗传突变的影响。方法:采用分子克隆、PCR等分子生物学实验技术。结果：在100 mL LB液体培养基中加入100 mg/mL氨苄青霉素35 μL对重复序列有明显删减。结论：治疗与重复序列相关的神经系统遗传疾病可以通过促进重复序列的有效删减，将重复序列数目控制在阈值之内来完成。
【关键词】 遗传病;重复序列;自然突变
Abstract Objective：To explore the impact of ampicillin on genetic mutations of (GAA)n·(TTC)n repeat sequence bacteria in the passage culture. Methods: Molecular cloning， PCR and other molecular biological techniques were used in the study. Results: 100mg/ml ampicillin35μl added to 100ml LB liquid medium remarkably deleted the repeat sequences. Conclusion: Treatment of genetic diseases of nervous system associated with repeat sequence can be achieved by promoting the effective deletion of repeats and keeping the number of repeats within the control threshold.
Key words Genetic disease; Repeat sequence; Natural mutation
迄今为止近40种神经系统遗传病的发生可能与三核苷酸重复序列的扩增有关[1]，如弗里德赖希共济失调与重复序列(GAA)n·(TTC)n的大量扩增有关[2]。正常人体内存在一定的重复序列，重复序列达到一定数目以上才会引起疾病。治疗与重复序列相关的神经系统遗传疾病的可行性方案是抑制重复序列的扩增或促进重复序列的有效删减，将重复序列数目控制在阈值之内，这对生物学研究及临床医学有非常重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 生物材料与试剂
大肠杆菌DH5α、pUC19质粒均为内蒙古大学实验室提供，含有重复序列(GAA)28的大肠杆菌、限制性核酸内切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ、PvuⅡ)、T4噬菌体多核苷酸激酶、RNaseA、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司，PleI酶购自NEB公司，质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根公司。其他试剂为国产(分析纯)。
1.1.2 实验仪器
高速冷冻离心机(Eppendorf 5810 R)，凝胶成像仪(GENE-GENIUS)，紫外-可见分光光度(Nanodrop)计，槽体冷却加热器(PHC-19型)，台式离心机(TGL-16 C)，超纯水仪(Bioscience-UBL214715)，电热恒温培养箱(DHP-9272)。
1.2 方法
1.2.1 克隆策略
化学合成寡核苷酸重复序列(GAA)7、(TTC)7，经磷酸化、杂交后与接头EP1/2、PB1/2以1∶5∶2(EP1/2∶重复序列∶PB1/2)做酶连反应，酶连产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后插入到克隆载体pUC19质粒中，转化进入大肠杆菌DH5α株型，在含有氨苄的平板上筛选重组子[3]。按常规方法进行细菌的培养以及质粒的小量制备，PvuⅡ酶切后电泳检测插入重复序列片段的大小。同时在接头中设计了PleI酶切位点，用PleI酶切重组质粒得到的小片段就是纯粹的插入序列。EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重组质粒得到的片段就是25 bp加上纯粹的插入序列。由此策略得到重复序列(GAA)28·(TTC)28。
1.2.2 自然遗传突变研究实验步骤
用接种环挑取冻存菌体(GAA)28·(TTC)28在LB固体平板上划线，恒温培养箱中37 ℃过夜培养以获得单菌落。用接种环挑取单菌落接入8 mL含氨苄青霉素(AMP)的LB液体培养基中，共3组，所加AMP(100 mg/mL)的体积分别为为30 μL、35 μL、40 μL。每组3个平行实验，37 ℃恒温培养振荡器培养，观察第一代菌体的生长情况。约7～8 h后用紫外分光光度计测得OD650为0.6左右，视为菌体生长的最佳状态。取200 μL菌液加到8 mL LB液体培养基中，摇第二代菌，37 ℃恒温培养振荡器培养，4～5 h保存菌体。在同样条件下，用同样的方法传代培养得到第七代菌体。对第一、三、五、七代菌体提取质粒DNA。
为了检测菌体在传代培养中AMP对遗传突变的影响，我们对第一代、第七代的部分质粒DNA进行PCR扩增检测，再用5 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，结果见图2。
PCR扩增：(1)模板：含有(GAA)28·(TTC)28的质粒DNA。(2)反应体系：采用25 μL体系，buffer加2.5 μL，Taq聚合酶加0.3 μL，根据模板的浓度不同模板加入的量不同。体系中引物EP1、PB2的原初浓度分别为1 908.8 ng/μL、1645.5 ng/μL，将其稀释100倍作为PCR扩增的引物，EP1、PB2均加4 μL。dNPT为25 mM设定体系时dNTP加3 μL。(3)反应程序：94 ℃预变性2 min、94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、72 ℃延伸5 min。本程序为30个循环。(4)电泳检测：5 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2 结果与分析
基因公司化学合成的寡核苷酸重复序列(GAA)7、(CTT)7经磷酸化、再次磷酸化、杂交后插入到克隆载体pUC19质粒中，转化进入大肠杆菌DH5α株型，在含有氨苄的平板上筛选重复序列的重组子。经过酶切鉴定后送往基因公司测序。TTC重复了28次，由于测序只测一条链，同理推出另一条链GAA 也重复了28次。见图1。图1 克隆重复序列(GAA)28.(TTC)28测序图 菌体的第一代与第七代相比，在AMP的体积为30 μL、40 μL都有删除作用。从第一代和第七代菌体的质粒DNA的PCR产物可明显看出有比原重复序列短的序列的扩增产物存在，即AMP促进了重复序列的删除。见图2。图2 PCR扩增产物5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳图M：100 bp的Ladder Marker;1、3、5、7泳道：第一代菌体质粒DNA的PCR产物;2、4、6、8泳道：第七代菌体的质粒DNA的PCR产物;9、10泳道：第一代和第七代菌体的质粒DNA的PCR产物;1-4泳道所加AMP(100 mg/mL)的体积为30 μL，5-8泳道所加AMP(100 mg/mL)的体积为40 μL
3 讨论
关于本实验中遗传突变的研究，菌体在LB液体培养基传代培养七代，在100 mL LB液体培养中加入AMP(100 mg/mL)30 μL、35 μL、40 μL对重复序列的删除均有效果，证明该菌体存在遗传突变。
参考文献
\[1\] Robert DW，Ruhee D，Micheal L，et al.Advances in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases\[J\].Nucleic Acids Research，2005，33(12)：3785-3798.
\[2\] Benjamin JL，Maryan B，Edward WC，et al.Structure and Dynamics in DNA Looped Domains:CAG Triplet Repeat SequenceDynamics Probed by 2-Aminopurine Fluorescence\[J\].Biochemistry，2007，46(38):10756-10766.
\[3\] 毛爱华，赵秀娟，蔡禄.与人遗传病相关(CTG)n·(CAG)n重复序列的分子克隆\[J\].内蒙古大学学报，2008，39(1):50-55.