作者：张利芳 程子英 王惠琴 邢少姬
【摘要】 目的：研究包头市肥胖儿童ApoE基因多态性。方法：从白细胞中提取基因组DNA，设计引物扩增ApoE基因，用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析其多态性。结果：本实验共检出4种ApoE基因型，分别是E3/3、E2/3、E3/4、E2/4，未检出E2/2、E4/4型;肥胖组与对照组等位基因ε2、ε3、ε4频率分布不均，ε3发生频率最高;与健康组儿童比较，肥胖组儿童ε4等位基因发生频率增高，差异有统计学意义(P&<0.05)。结论：ApoE基因多态性与儿童肥胖有一定关系。
【关键词】 肥胖儿童;ApoE基因;多态性
人类载脂蛋白E(ApoE)基因位于19号染色体，具有明显的基因遗传多态性。ApoE有3种主要的异构体，即E2、E3、E4，它们分别由一个基因位点的3个等位基因ε2、ε3、ε4编码。ApoE是血清中主要载脂蛋白之一，参与机体脂质代谢及调节胆固醇平衡[1]。ApoE三种异构体与受体的亲和力不同而影响脂代谢，从而不同程度地影响血脂水平。高血脂可以引发动脉粥样硬化、高血压、冠心病、肥胖等慢性疾病，具有潜在危险。本文研究了我市部分肥胖儿童的ApoE基因多态性，为下一步探讨肥胖儿童ApoE基因多态性及与血脂关系的研究提供基础材料。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
HhaⅠ酶(美国BioLabs公司)，pBR322DNA/MspI marker(北京TIANGEN BIOTECH公司)，PCR扩增试剂(大连宝生物公司)。
1.2 研究对象
根据《中国学龄儿童青少年BMI超重、肥胖筛查分类标准》选择本市两所中学肥胖儿童60名，其中男42名，女18名，年龄12～14岁，平均年龄13.2岁;对照组健康儿童60名，其中男38名，女22名，年龄12～14岁，平均年龄13.3岁。两组对象均为汉族。
1.3 采血及白细胞DNA基因组提取方法
受检者空腹12～14 h，消毒后于肘静脉取血1 mL注入EDTA抗凝管储存。白细胞DNA基因组提取采用常规酚-氯仿抽提法。 1.4 PCR引物设计[2] P1：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′;P2：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′;由上海生工生物工程技术公司合成。
1.5 ApoE基因PCR扩增
预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。以琼脂糖电泳鉴定。
1.6 HhaⅠ酶切
扩增产物20 μL用10 U内切酶HhaⅠ，进行酶切。
1.7 酶切产物电泳
12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，25 mA 3～4 h，EB染色，紫外下观察条带。E2/2基因型为91、81 bp，E2/3型为91、81、48 bp，E3/3为91、48 bp，E3/4为91、72、48 bp，E2/4为91、81、72、48 bp，E4/4为72、48 bp。
1.8 统计学分析
数据应用SPSS11.5软件进行分析，分类资料用频数表示，分类资料组间比较用χ2检验。
2 结果
2.1 PCR产物电泳
扩增出预期244 bp大小ApoE基因片段，见图1。图1 PCR扩增产物电泳结果2.2 PCR产物酶切电泳 HhaⅠ酶切PCR产物电泳结果共显示4种基因型，分别为E3/3：91、48 bp;E2/3型：91、81、48 bp;E3/4：91、72、48 bp;E2/4：91、81、72、48 bp。未发现E2/2和E4/4基因型，见图2。图2 ApoE基因HhaⅠ酶切电泳结果
2.3 ApoE基因频率
肥胖组与对照组等位基因频率分布不均，以ε3最常见。与对照组比较，肥胖组儿童基因含E4的杂合子(E3/4+E2/4)明显增高(25.0 %)，而对照组为8.3 %，两组比较发现，肥胖组儿童ε4等位基因频率增高(χ2=4.42，P&<0.05)。详见表1。
3 讨论
近年来，ApoE基因已经成为研究肥胖病的热点，ApoE基因在调节血脂和脂蛋白代谢方面有着非常重要的作用，被认为是肥胖的重要候选基因[3]。大量研究表明，ApoE基因多态性影响血脂浓度，与高血脂、动脉粥样硬化、冠心病、肥胖等密切相关。儿童肥胖已经成为世界公共问题，肥胖与遗传有关，目前认为ApoE基因有可能是儿童血脂水平异常的遗传标志，研究儿童ApoE基因多态性能为解决儿童肥胖和高血脂问题提供基础资料。表1 肥胖儿童组与健康儿童组ApoE基因型及等位基因频率本实验共检出4种ApoE基因型，分别是E3/3、E2/3、E3/4、E2/4，未检出E2/2、E4/4型。肥胖组与对照组基因组成不同，等位基因ε2、ε3、ε4频率分布不均，以ε3发生频率最高，ε2、ε4等位基因发生频率低，与国外报道基本相似。与对照组比较，肥胖组儿童含E4的杂合子(E3/4+E2/4)明显增高(25.0 %)，而对照组为8.3 %。ε4等位基因与血脂升高和冠心病(CHD)发病有一定的相关性，是CHD的重要遗传标志[4]，ε2则对人体有保护作用。我们发现包头市区肥胖儿童ε4等位基因发生频率增高，说明肥胖儿童已存在促进CHD的危险因素。我们还将进一步研究ApoE基因多态性与血脂水平的关系，研究肥胖儿童与正常对照儿童在血脂代谢水平上的差异，以找出ApoE基因多态性对TG、TC、HDL-C、LDL-C代谢水平的影响。大量研究已经证明，ApoE基因多态性对血脂的影响显著[5]。在儿童中开展ApoE基因多态性的选择性筛选检查，可早期发现并对发生高脂蛋白血症和冠心病的高危儿童进行有效的防治是临床不久的愿望。
参考文献
\[1\] 王伟，杨肃文，应静芝.杭州地区肥胖儿童的ApoE基因HhaⅠ酶切位点多态性研究\[J\].浙江预防医学，2005，17(6)：54-55.
\[2\] Maria GV，Gottlieb，Carla HA.Schwanke，et al.Association among oxidized LDL levels，MnSOD，apolipoprotein E polymorphisms，and cardiovascular risk factors in a south Brazilian region population\[J\].Genet Mol Res，2005，4(4):691-703.
\[3\] 王莲，刘长云，赵园园，等.纯性肥胖儿童脂代谢与LEPR及ApoE基因多态性的相关性研究\[J\].中华妇幼临床医学杂志，2007，3(4)：189-193.
\[4\] 李伟，管思明，戚本玲，等.年冠心病者载脂蛋白E多态性检测的临床意义\[J\].中华老年医学杂志，2003，4(22)：214-217.
\[5\] 朱建华，潘闽，王慧民，等.载脂蛋白E基因多态性与健康人群血脂谱改变的关系\[J\].临床心血管病杂志，2002，18(2):63-65.