天冰调督胶囊对点燃法致癫痫大鼠记忆行为学改变的影响

　　　　 作者：裴林 刘春燕 裴逸然 贾晓明 白文忠 马学伟

【摘要】 目的 观察天冰调督胶囊对印防己毒化学点燃法致癫痫大鼠学习记忆行为学改变的影响。方法 用印防己毒点燃法建立癫痫大鼠模型，观察天冰调督胶囊的疗效，并以丙戊酸钠、拉莫三嗪作为对照观察。分别用大鼠Morris水迷宫、交替电刺激Y迷宫评价大鼠学习与记忆。结果 天冰调督胶囊可明显改善癫痫模型大鼠水迷宫、交替电刺激Y迷宫空间学习记忆指标，迷宫错误次数明显少于模型组，中药高量组并与拉莫三嗪组无显著差异；中药各组寻找平台时间明显缩短，并与丙戊酸纳组比较有一定优势。结论 天冰调督胶囊可提高印防己毒化学点燃法致癫痫大鼠学习记忆行为，对促进患者康复具有积极意义。

【关键词】 天冰调督胶囊；癫痫大鼠；学习记忆；行为学

　　癫痫患者多伴有注意力分散、学习记忆功能减退等认知功能受损的表现，特别是在长期癫痫发作伴学习记忆障碍的中老年癫痫患者，生活质量受到严重影响，为国内外专家治疗关注的热点之一〔1，2〕。而现有常用抗癫痫药甚至对认知功能有一定损害作用。因此，抗癫痫的同时能改善认知功能的药物研究具有重要的临床指导意义。本文在临床应用天冰调督胶囊治疗癫痫认知障碍取得一定疗效的基础上，观察该方药对印防己毒素（PTX）化学点燃癫痫模型大鼠认知行为学的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠，100只，购自河北医科大学实验动物中心（合格证编号：DK0411 0005），清洁级，起始体重110～130 g，于实验室专人适应性饲养1 w，实验前自由饮食，12 h光亮/黑暗条件、22℃～25℃环境温度，分隔喂养，饲养地点在中药药理学实验室（Ⅱ级）。

　　1.2 药物及试剂

　　天冰调督胶囊（调肝解毒方）主要成分为柴胡、桂枝、天麻、全蝎、人工牛黄、黄连、绞股蓝等，中药饮片由河北省中医药研究院饮片厂提供，河北省中医药研究院制剂室研制（冀药制字Z20050746）的浓缩浸膏，并严格按照经省药监局批准质量标准执行〔3〕。丙戊酸钠：湖南湘中制药有限公司（批号：20041206），规格：200 mg/片；拉莫三嗪：Glaxo Operations UKLimited生产(批号：ZJ0010)。各药存4℃冰箱供实验用，临用时分别配成不同浓度的悬浊液，灌胃时温服。PTX：美国Sigma公司，规格：1 g/瓶。临用时溶于生理盐水，配置成0.01%溶液，存4℃冰箱供实验用。

　　1.3 仪器

　　Morris水迷宫、交替电刺激Y迷宫：北京硕林苑科技有限公司，水迷宫水池的上方装有摄像系统，记录保存大鼠的运动轨迹。脑立体定位仪、生理机能信号采集与分析系统、脑电图仪等。

　　1.4 癫痫大鼠模型制备

　　按文献〔4，5〕方法，每天上午10:00至11:30腹腔注射PTX 1.5 mg/kg，连续注射20～30 d，达到完全点燃时停止造模。每次注射后观察大鼠30 min，注射20 d起以录像机观察24 h大鼠的动态变化，记录发作潜伏期、发作时症状表现与持续时间。点燃大鼠癫痫发作行为分级标准依据Racine〔6〕分级标准分为五级，凡获得连续３次4级或4级以上完全发作者，被认为完全点燃。
　　
　　1.5 点燃大鼠脑电图的确认

　　随机选取未造模正常组大鼠2只、完全点燃模型大鼠3只，进行发作间期脑电图描记。点燃癫痫大鼠出现阵发性痫性放电的高幅多棘综合波，持续1～2 s，表明造模成功。描记后大鼠不再加入后期实验中。

　　1.6 实验分组与治疗方法

　　剔除未达点燃标准或点燃过程中死亡及脑电图检测的大鼠，随机选取点燃成功大鼠75只，分为模型组、中药低量组、中药高量组、丙戊酸钠组和拉莫三嗪组，每组15只大鼠。正常组大鼠15只同期进行观察。

　　各组于造模第30 d开始连续灌胃观察，每100 g体重灌服1 ml，每日1次，共持续60 d。正常对照组、模型组灌服生理盐水（10 ml/kg体重）；中药低量组、中药高量组分别以混悬液（0.4、0.8 g/kg含生药量）灌胃；丙戊酸钠组（0.008 g/kg）、拉莫三嗪组（0.002 g/kg）混悬液灌胃给药。各组均以自来水为饮料，自由饮用，自由摄食。分别于模型成功后24 h和干预治疗60 d后进行相关指标测试。

　　1.7 交替电刺激Y迷宫试验
　　
　　①学习训练阶段将大鼠置于Y迷宫1臂，通电给予足部最小电刺激(初始刺激电压为20 V)，并以5 V为间隔单位上调刺激强度，直至大鼠有反应。电刺激5 s后同时拉起三臂的移动门，这时大鼠逃离1臂，如进入2臂给以相同强度的电刺激，通电持续到大鼠进入3臂，该臂中无电源刺激，臂端红灯亮。30 s后开始第2次尝试，改为以3臂为起始臂，1臂为目标臂，2臂为错误臂。第3次试验和第1次一样，以1臂为起始臂，3臂为目标臂。按此交替顺序进行30次尝试，每次间隔均为30 s。②记忆保持阶段于学习训练24 h后进行，不进行大鼠的5 min适应过程，操作与第1天相同，试验规定大鼠受电击后从起始臂直接逃至安全臂为“正确反应”，先进入通电臂则为“错误反应”，并记录为1次错误，以动物选择错误次数作为评价大鼠学习与记忆能力指标。

　　1.8 Morris水迷宫指标测试〔7〕

　　①定位航行实验实验历时5 d，第1天让大鼠自由游泳2 min；从第2天起，每天分上、下午两段，每段训练4次，训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察记录大鼠每天最后一次训练时寻找并爬上平台所需时间，4次训练大鼠分别从四个不同的入水点入水，如果大鼠在2 min内未找到平台，需将其引至平台，这时潜伏期记为2 min，每次训练间隔60 s。②空间搜索实验在第6天的第5次训练时撤除平台，然后任选一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，测其在2 min内跨过直径为10 cm的原平台所在位置的次数。

　　1.9 统计学方法

　　各组检测结果以x±s表示，所有数据均采用SAS6.12统计软件包进行t检验或ANOVA分析。

　　2 结果

　　2.1 PTX点燃大鼠癫痫发作行为学改变

　　点燃大鼠一般在注射PTX 5～10次即开始出现发作，多为1～2级，表现为反复洗脸、咀嚼、须动、面部抽搐或点头，症状逐日加重，10～20次注射PTX后，出现肢体或躯干抽搐或阵挛，20～30次注射自发出现3次以上强直～阵挛发作，以及情绪改变（易激惹、躁狂），达到4～5级点燃标准。点燃各组大鼠饮食无明显变化，体重增长正常。观察治疗过程中，模型组、中药低量组、中药高量组各有1只大鼠死亡。正常组大鼠无癫痫发作，大鼠行为、饮食无明显改变，体重增长正常。

　　2.2 交替电刺激Y迷宫试验结果

　　模型组大鼠与正常组比较，模型组大鼠选择错误次数在第1、2天均比正常组明显增加（P＜0.01）。治疗后用药干预各组与模型组比较错误次数均有所减少，其中中药高量组及拉莫三嗪组与模型组比较差异显著（P＜0.05，P＜0.01），见表1。表1 治疗后各组大鼠Y迷宫错误次数比较(略)

　　2.3 水迷宫实验结果

　　随实验天数的增加，各组大鼠寻找平台时间逐渐减少，而模型组比同日正常组寻找平台时间明显延长（P＜0.01，P＜0.05）。模型组跨过原平台次数比正常组明显减少（P＜0.001）。治疗后中药高量组、中药低量组分别与模型组比较，寻找平台时间明显缩短（P＜0.01，P＜0.05）；中药高量组、中药低量组与丙戊酸钠组比较，在第3、4、5天寻找平台时间明显缩短，有显著差异（P＜0.01）。结果见表2；治疗后中药高量组、中药低量组、拉莫三嗪组与模型组比较，通过平台次数均明显增加（P＜0.01，P＜0.05））；中药高量组与丙戊酸钠组比较，通过平台次数明显增加（P＜0.05），见表2。表2 治疗后各组大鼠水迷宫寻找平台时间及通过平台次数比较(略)

　　3 讨论
　　
　　在癫痫患者中，约50%伴有不同程度的认知功能损害。近年研究显示全面性惊厥性癫痫/颞叶癫痫、复杂部分性癫痫均可引起认知功能异常，即使失神性癫痫也有轻微的认知功能缺陷〔8〕。随着患者病程的延长，其学习记忆能力的下降愈加明显，因此探讨相关作用机制，寻找有效的治疗药物成为研究热点之一。

　　学习与记忆是有密切联系的神经生物过程，从整体水平研究动物学习和记忆能力，由于操作简单、快捷，得到广泛的应用与认可。交替电刺激Y迷宫主要用于辨别学习、工作记忆和参考记忆的测试，用不同程度的电击刺激大鼠足底，大鼠则以逃避反应学会Y迷宫左右交替的工作记忆模式，以检测大鼠的学习分辨空间及逃避性记忆，迅速测定学习记忆并对完成空间记忆敏感。Morris水迷宫试验是一种研究与海马功能直接相关的空间学习记忆的方法〔9〕，属于经典的学习记忆实验方法，大鼠在进行水迷宫训练时，其海马的形态结构也发生相应的可塑性变化，所以水迷宫法适合癫痫以海马脑神经细胞可塑性改变为对象的实验。
　　
　　本研究结果表明，经交替电刺激Y迷宫、Morris水迷宫试验结果互参，无论是模型点燃的初期，还是经过两个月的观察或治疗后，与相应的正常组大鼠比较，PTX化学点燃癫痫模型大鼠存在明显的学习与记忆过程的障碍。应用不同剂量天冰调督胶囊干预，可明显改善大鼠的学习与记忆过程，并且作用优于丙戊酸钠，表明该方药确有改善点燃癫痫模型大鼠的学习记忆作用，对治疗癫痫学习记忆障碍或许有积极作用。丙戊酸钠对认知无明显影响〔10〕，本研究中丙戊酸钠组部分指标的改善，可能与该药控制了癫痫惊厥发作，进而改善学习记忆有关。

参考文献

　　1 Bulteau C，Jambaque I，Viguier D，et al.Epileptic syndromes，cognitive assessment and school placement:a study of 251 children〔J〕.Dev Med Child Neurol，2000；42（1）:31927.

　　2 Kwan P，Brodie MJ.Neuropsychological effects of epilepsy and anti epileptic drugs〔J〕.Lancet，2001；357（1）:21622.

　　3 阎向东，牛会芬，徐佳曦，等.天冰调督胶囊质量标准研究〔J〕.中成药，2007；29(4):5402.

　　4 Shandra AA，Mazarati AM，Godlevsky LS，et al.Chemical kindling:implications for antiepileptic drugssensitive and resistant epilepsy models〔J〕. Epilepsia，1996；37(3):26974.

　　5 田发发，谢光洁，杨期东，等.实验性癫痫与γ氨基丁酸和谷氨酸脱羧酶的关系〔J〕.中华神经科杂志，2000；33(4):2246.

　　6 徐叔云，卞如濓，陈 修.药理实验方法学〔M〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2005：872.

　　7　Devan BD，White NM.Parallel information processing in the dorsal striatum：relation to hippocampal function〔J〕.J Neurosci，1999；19（1）:278998.

　　8 Erdogan F，Golgeli A，Arman F，et al.The effects of pentylenetetrazole induced status epilepticus on behavior，emotional memory，and learning in rats〔J〕.Epilepsy Behav，2004；5（7）:38893.

　　9 D′Hooge R，De Deyn PP.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory〔J〕.Brain Res Rev，2001；36（1）:6090.

　　10 Brunbech L，Sabers A.Effect of a antiepileptic drugs on cognitive function in inpiduals with epilepsy:a comparative review of newer versus older agents〔J〕.Drugs，2002；62（4）:593604.