血管生长抑制因子与CD34在胆管癌组织中的表达及其临床意义

【关键词】 血管生长抑制因子；CD34；胆管癌

　　本研究采用免疫组化法检测胆管癌组织中血管生长抑制因子（angiostatin，AS）和微血管密度（MVD）的表达，并分析其与胆管癌临床病理参数间的关系，以探讨AS和CD34与胆管癌发生、发展及预后的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源

　　收集沈阳医学院奉天医院普外科 2008年1月至2009年12月外科手术治疗的胆管癌组织标本 45 例，病理证实均为胆管癌。其中男 18 例，女 27 例，年龄 58～76 岁。根据 WHO 病理分类标准，高、中分化腺癌 33 例，低分化腺癌 12 例。肿瘤部位：胆总管中下段 27 例，肝门部 18 例。经肉眼或病理所见有浸润转移者 31 例，无转移者14 例。手术切除率 71.1%（32/45），手术根治切除率 28.8%（13/45）。所有患者术前均未接受化疗和放疗。另取正常胆管标本11例为对照。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人血管抑素单克隆抗体，美国Zymed公司产品，购自北京中衫金桥生物技术有限公司；鼠抗人CD34单克隆抗体为美国迈新公司产品，购自福州迈新生物技术开发公司；SP试剂盒（包括：A、过氧化物酶阻断剂；B、正常动物非免疫血清；C、生物素标记的第二抗体；D、链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶）；DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司产品）；SABC试剂盒（武汉博士德公司产品）。

　　1.3 免疫组化染色

　　应用免疫组织化学SP染色技术，检测AS和MVD在胆管癌组织中的表达。已知胆管癌标本做阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。11例正常胆管组织标本为正常组织对照。

　　1.4 结果判定标准

　阳性结果判定：均以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，不出现者为阴性。高倍镜下取5个高倍视野，各计算100个癌细胞中阳性细胞所占的比例，取平均值。染色强度与阳性细胞所占百分比乘积＞3分为（+），6～9分为（），9～12分为（）；9～12分为高表达，6分以下为低表达。凡（+）及以上者均为阳性表达。MVD判断：采用抗CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，即MVD，可由此衡量肿瘤血管生成的活跃程度。MVD计数方法按照Weidner方法〔5〕进行，即与背景明显区别的任何一个棕色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连续，分支结构也作为一个血管。在双盲法下进行，每张切片由两人分别判定计数，两人计数相差10 %以上者重新计数。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS13.0软件包。AS与临床病理特征之间等级相关资料采用非参数秩和检验，计数资料采用χ2检验；MVD与胆管癌临床病理特征及与TN表达关系的分析用均数t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以α= 0.05作为检验水准。双向有序分类资料相关性统计采用Spearman等级相关检验。

　　2 结果

　　2.1 AS在不同胆管组织中的表达

　　AS阳性表达定位于细胞质和细胞核，以细胞质表达为主。在正常胆管及胆管癌组织中均可见到AS阳性染色，肿瘤间质细胞也可见阳性染色。AS在胆管癌组织内的表达呈明显的异质性，大部分癌组织边缘区细胞染色强于中心区，部分癌组织坏死周边区可见强阳性染色出现，内皮细胞及血管壁可见均匀的AS阳性染色。正常组织AS阳性表达率18.2% (2/11)，胆管癌组织阳性表达率60.0% (27/45)，二者相比差异有统计学意义(χ2= 6.19，P&<0.05)。结果表明，胆管癌组织中AS呈过表达状态。

　　2.2 MVD在不同胆管组织中的表达

　　CD34抗体特异表达于血管内皮细胞质中。MVD染色阳性细胞为血管内皮细胞染成棕黄色或褐色，肿瘤内血管分布呈现异质性，在肿瘤组织浸润前缘密度较高，而在硬化坏死区则较稀疏。11例非肿瘤性胆管组织、45例胆管癌组织的MVD表达率分别为26.80±5.14和31.78±4.41，有显著差异性（P&<0.05）。

　　2.3 胆管癌组织中AS和MVD的表达与临床病理参数的关系 胆管癌组织中AS的表达与性别、年龄、肿瘤部位及肿瘤的分化程度等无相关性（P＞0.05）；而与肿瘤有无淋巴结转移有非常显著性相关（P&<0.05）。MVD与淋巴结转移、肿瘤的分化程度及肿瘤部位相关（P&<0.05），而与患者年龄和性别无关（P&>0.05），见表1。表1 AS和MVD与胆管癌临床特征的关系(略)

　　3 讨论
　　
　　AS具有特异的抑制内皮细胞生长、抑制血管新生、抑制肿瘤生长和转移的活性，且动物实验中未见其耐受性、抗原性及毒副作用〔1〕。CD34即血小板内皮细胞黏附分子，广泛分布于血管内皮细胞，在血管和淋巴管内皮细胞均有表达，是内皮细胞标记物，参与血管生成，可作为MVD定量的指标，而且具有较高的特异性和敏感性，是评估新生血管的金标准，并与肿瘤转移有关〔2〕。
　　
　　在细胞水平上AS特异性地抑制内皮细胞的增殖，对正常细胞和肿瘤细胞的增殖无抑制作用。其间接抑制原发性和转移性肿瘤生长的作用机制在于使肿瘤细胞发生凋亡，肿瘤细胞的增殖和凋亡相平衡，即肿瘤细胞处于休眠状态。最近，Walter等〔3〕证实AS还可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而促成其抗血管生成作用。Miwa等〔4〕发现对于增殖的内皮细胞，AS可选择性地提高E2选择素的多肽表达，同时E2选择素的mRNA和黏附活性也相应提高。利用小鼠异种移植人神经纤维瘤的体内模型，Koukourakis 等〔5〕研究发现，AS可降低VEGF mRNA水平，指出AS抑制肿瘤的生长部分是由下调VEGF 的表达来实现的。在本实验中，AS的表达强度与胆管癌的发生部位及淋巴结转移呈正相关。AS在胆管癌组织中的高表达提示肿瘤恶性程度增高，血管形成促进因子及蛋白水解酶分泌增加，导致更多的血管抑制因子释放来对抗促血管因子的刺激作用。近年来在肿瘤领域研究的重大进展之一就是确立了肿瘤血管生成在肿瘤发展中的重要地位与抗血管生成治疗肿瘤的意义，Breohm等〔6〕首先提出肿瘤内MVD与肿瘤分级、浸润有关，Weidner等〔7〕应用FⅧRA单克隆抗体标记血管内皮细胞发现肿瘤内MVD与腋下淋巴结转移或远处转移有显著相关，并得出腋下淋巴结FⅧRA阳性乳腺癌患者的肿瘤内MVD比阴性患者显著增高，他们认为肿瘤内MVD与血管浸润有关，能增加肿瘤细胞脱落，并经淋巴管和血管向远处转移。近年来应用CD31、CD34、E9、TEC11等新的血管内皮细胞标志物等对乳腺癌、肝癌、肺癌、直肠癌及骨肉癌等肿瘤内MVD的计数研究都证实：肿瘤内MVD与肿瘤预后关系极为密切，肿瘤组织内MVD可作为部分肿瘤的分化、分级和评价预后的一项有价值指标〔3，5〕。国内外许多学者研究证实，MVD是一个独立而重要的预后因素。有少部分学者认为高MVD患者较低MVD度患者生存期长，MVD增高提示预后良好〔8〕。本研究结果与大部分的报道一致，淋巴结转移阳性组的MVD较淋巴结转移阴性组明显增大，认为高MVD提示肿瘤易发生转移和预后不良。结果显示，胆管癌的中高、低分化组的MVD依次增大，说明肿瘤的恶性程度越高，肿瘤细胞的增殖速度也越快，微血管形成也越多。临床上常可观察到原发肝门胆管癌切除后，短期内出现肿瘤的转移和复发的情况。MVD增加标志着肿瘤转移潜能的增加，MVD与胆管癌淋巴结转移、病理学分期关系密切，由此推测MVD可能与胆管癌的转移和预后有关。

参考文献

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　　5 Koukourakis MI，Giatromanolaki A，Thorpe PE，et al.Vascular endothelial growth factor/ KDR activated microvessel ensity versus CD31 standard microvessel density in nonsmall cell lung cancer〔J〕.Cancer Res，2000；60(11)：308892.

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