特异性1023脱氧核酶对肝癌相关基因IGFⅡmRNA的体外切割作用

【摘要】 　　目的 体外观察1023脱氧核酶（DRz）对肝癌相关基因胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ) mRNA的切割活性。方法 用RTPCR方法扩增出IGFⅡ基因的cDNA 片段，然后定向克隆到质粒PGEM3Z T7 启动子的下游，获得重组质粒PGEM3ZIGFⅡ，用限制性核酸内切酶HindⅢ 将重组质粒线性化后，在体外转录出IGFⅡ基因的mRNA片段，作为DRz切割的底物。结果 在无细胞系只观察到DRz1具有切割靶mRNA的作用，DRz2，DRz3和ASODN均未显示出切割活性。结论 筛选出的活性DRz1可进一步的用于细胞内实验。

【关键词】 原发性肝细胞肝癌；基因治疗；胰岛素样生长因子Ⅱ；脱氧核酶

　　人胰岛素样生长因子Ⅱ（insulinlike growth factorⅡ，IGFⅡ）是IGFs基因家族成员之一，是调节人和胚胎发育必需的生长因子，肝脏是合成和分泌IGFⅡ的主要器官。研究表明，IGFⅡ与肝癌的发生发展密切相关，多种肝癌细胞株可以通过自分泌或旁分泌IGFⅡ的方式调节其自身和转移灶的生长〔1～3〕，因此可将IGFⅡ作为肝癌基因治疗的潜在靶点。1023脱氧核酶（deoxyribozymes，DRz）是具有RNA切割功能的单链DNA分子，通过两边的底物结合臂与靶mRNA特异性结合后，对靶mMRA 具有高效、特异的切割作用，从而可以在mRNA水平上抑制基因的表达，达到基因治疗的目的。本研究共设计3条针对IGFⅡmRNA的DRz，观察其在体外对靶mRNA的切割作用，探讨脱氧核酶在肝癌基因治疗方面的应用前景。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　HepG2肝癌细胞由长春肿瘤研究所提供，PGEM3Z质粒、JM109菌株和T7体外转录试剂盒均购自Promega公司，RTPCR试剂盒、DNA连接试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒、Trizol试剂、核酸内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ均购自Takara公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞总RNA的提取

　　用含有10%血清的培养液培养HepG2肝癌细胞至70%融合期，收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA。

　　1.2.2 IGFⅡcDNA片段的获得

　　根据GenBank中IGFⅡ基因序列设计两对引物，采用巢式PCR扩增出长度为331 bp DNA片段。第一轮PCR反应上游引物F1：5′GCTCTGCCCCGTCGCACATTC3′，下游引物R1：5′CGGGGTATCTGGGGAAGTTG3′，扩增产物长度为475 bp；第二轮PCR反应上游引物F：5′gaattcCTGTTCGGTTTGCGACAC3′，下游引物R：5′aagcttGTAGCACAGTACGTCTCCAG3′，扩增产物长度为331 bp，小写字母部分分别为EcoRⅠ和Hind Ⅲ 的酶切位点。引物由大连宝生物工程公司合成。
　　
　　以R1为特异性引物，以提取的总RNA为模板合成cDNA，反应条件为42℃，60 min，99℃ 5 min灭活AMV，5℃ 5 min。取RT产物10μl，以F1和R1为引物，进行第一轮PCR扩增，反应条件为94℃预变性10 min，94℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s扩增30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色观察结果。以F和R为引物，PCR产物为模板，进行二次PCR扩增，反应条件同上。

　　1.2.3 重组质粒的构建及鉴定

　　将第二轮PCR回收产物和PGEM3Z质粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ37℃酶切4 h，切胶回收目的片段，16℃水浴反应60 min，构建PGEM3ZIGFⅡ质粒，具体方法按分子克隆实验指南操作。挑取阳性克隆进行双酶切鉴定后进行测序。

　　1.2.4 IGFⅡmRNA的获取

　　抽提纯化重组质粒PGEM3ZIGFⅡ，用Hind Ⅲ将质粒进行单酶切，使之线性化后用T7体外转录试剂盒获取IGFⅡmRNA，步骤参照说明书进行。

　　1.2.5 不同位点1023DRZ对靶RNA的切割反应

　　首先采用RNA Structure4.2软件对IGFⅡmRNA的二级结构进行分析，针对IGFⅡmRNA的起始区和编码区的保守位点分别设计脱氧核酶DRz1、DRz2和DRZ3作为对照，设计针对相同底物的17nt的反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）。DRz1：5′GATTCCCAGGCTAGCTACAACGATGGTGTCT3′；DRz2：5′CACCAGCAGGCTAGCTACAACGACGACTTCC3′；DRz3：5′AAACAGCAGGCTAGCTACAACGATCCTCAAC3′。划线部分为DRz的活性中心，未划线部分为底物结合臂。ASODN1：5′GATTCCCATTGGTGTCT3′；ASODN2：5′CACCAGCATCGACTTCC3′；ASODN3：5′AAACAGCACTCCTCAAC3′。将DRz1、DRZ2和DRz3各5 pmol分别与底物RNA 5 pmol混合，总反应体系20μl。在37℃、TrisHcl（pH7.4）50 mmol/L、MgCl2 10 mmol/L条件下，反应20 min后，加入等体积的甲酰胺上样缓冲液终止反应。加入ASODN作为阳性对照，未加入DRz作为阴性对照。将反应物95℃变性5 min后置冰上，用含7 mol/L尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色观察结果。

　　2 结果

　　2.1 IGFⅡ基因的获取及鉴定

　　从HepG2中提取总RNA，经过第一轮PCR扩增后出现很多杂带，采用巢式PCR的方法扩增出331 bp的IGFⅡ基因片段（图1）。将此片段克隆载体PGEM3Z中，获取PGEM3ZIGFⅡ重组质粒，用 EcoRⅠ和Hind Ⅲ对重组质粒进行双酶切鉴定，显示酶切下的条带与331 bp的目的DNA大小相符，测序结果正确（图2）。

　　2.2 不同位点1023DRz对靶mRNA的切割反应

　　各体系反应完成后，经8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示DRz1具有切割底物RNA的活性，而DRz2和DRz3及阳性对照ASODN均未显示出切割活性（图3）。
　　
　　3 讨论
　　
　　由于原发性肝细胞性肝癌（HCC）的生存期短，发展快，转移早，预后差，因此传统的手术、放疗、化疗及西医结合">中西医结合治疗的中远期疗效并不理想。随着肿瘤生物治疗的兴起，人们开始尝试从基因治疗的角度来探索肝癌治疗的新途径并取得了一定的进展。
　　
　　脱氧核酶是从体外筛选获得的一类有催化活性的单链DNA分子，其分子量较小，结构相对简单，受靶序列二级结构的影响较小，因此对底物的趋近性较好〔4，5〕，在同等温度、离子强度等条件下其稳定性约为RNA的105倍〔6，7〕，且DNARNA杂合分子较RNARNA杂合分子易于解离，故剪切速率受产物解离过程的影响少〔4，8〕。由于底物识别臂特异性识别序列的长度可达18个碱基以上，因此特异性极高。此外，脱氧核酶易于人工合成，在催化过程中不需胞内酶类的参与，而且它具有与一般药物相似的动力学特点，对靶RNA水平的抑制程度及时间容易控制，这就决定了脱氧核酶在医药和生物学上的不可取代性和开发的必要性。
　　
　　本研究针对IGFⅡmRNA设计的3个脱氧核酶在无细胞系中只观察到DRz1具有特异切割底物RNA的作用，而DRz2、DRz3均未显示出切割活性，可能与RNA靶点的可及性有关。因为DRz对底物RNA的有效作用必须依赖于酶与底物结合形成复合物，而复杂的RNA空间结构可能遮蔽其靶位点，阻碍酶的切割作用。本研究中底物RNA二级结构是通过RNA Structure4.2软件模拟出来的，与其实际的空间结构可能有一定的差异。所以为了避免靶点选择的盲目性应该选择更加有效的筛选方法，如mRNA分子可及位点的筛选（RNA Accessible Site Screening， RASS）及SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）等，从而得到更加准确和高效的作用靶点。DRz1是针对IGFⅡmRNA起始区设计的，起始区一般是反义药物作用的理想靶序列，这是因为针对它设计的反义药物可以从源头上抑制目的基因的表达；同时因为在转录起始阶段mRNA几乎不会形成二级结构，这样可以从一定程度上克服底物RNA自身折叠对靶序列的包埋作用。因此，有效靶点的选择对于DRz切割RNA活性起着至关重要的作用。
　　
　　综上，脱氧核酶所展示的多种优势显示出其巨大的应用潜能，本研究筛选出的DRz1将用于后续的细胞内实验，探讨DRz1在细胞内对IGFⅡ的切割作用及其对肝癌细胞的影响。

参考文献

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