心气虚证模型大鼠学习记忆和脑内胆碱能系统变化

　　　　 作者：郁志华 林水淼 陈久林

【摘要】 　　目的 观察心气虚证模型大鼠学习记忆和脑内皮层部位胆碱能系统的变化，探讨心气虚证模型大鼠学习记忆能力下降的机制，阐明中医“心主神明”的物质基础。方法 SD大鼠随机分为5组：正常对照组、疲劳对照组、小剂量普萘洛尔+疲劳组、中剂量普萘洛尔+疲劳组和大剂量普萘洛尔+疲劳组，采用强迫跑步加灌服普萘洛尔的方法建立心气虚证大鼠模型，采用Morris水迷宫法检测大鼠学习记忆能力，生化比色法检测乙酰胆碱酯酶(AchE)，放免法检测M受体。结果 大剂量普萘洛尔+疲劳组出现学习能力的降低，皮层AchE活性显著增高，M受体Rt值显著降低。结论 心气虚证模型大鼠出现脑内胆碱能功能紊乱，可能是造成学习记忆能力下降的物质基础。

【关键词】 心气虚证；乙酰胆碱酯酶；M受体

　　【Abstract】 Objective To observe the changes of cortex cholinergic system in rats of heartQi deficiency syndrome， explore the possible mechanism of learningmemory deficit in rats of heartQi deficiency and illustrate one of traditional Chinese medical theory that the heart governs the mental activities. Methods SD rats were randomly pided into 5 groups: normal (N)， exerciseinduced fatigue (F)， small dose propanolol + exerciseinduced fatigue (SF)， middle dose propanolol + exerciseinduced fatigue (MF) and great dose propanolol + exerciseinduced fatigue groups (LF). The rat models of heartQi deficiency syndrome were established by using complex factors including forced running till exhaust and gavage propanolol. The ability of learning and memory were measured by Morris water mazetest， biochemical colorimetry was applied to determine the activity of acetylcholine esterase (AchE). M receptor was estimated by radioimmunity method. Results In LF group， ability of learningmemory descended， the activity of AchE in cortex increased and Rt value of M receptor decreased obviously. Conclusions The dysfunction of cholinergic system possibly is the material basis of learningmemory deficit in rats of heartQi deficiency.
　　
　　【Key words】 HeartQi deficiency syndrome；Acetylcholine esterase；Rt value of M receptor
　　　
　　中医认为心在五脏六腑的功能中居于最重要的地位，《素问·灵兰秘典论》曰：“心者，君主之官，神明出焉”，“主不明则十二官危”，可见中医认为心与脑之间的关系密切。现代医学认为心脏是全身血液循环的原动力，但与脑功能的关联性研究尚属起步阶段。本实验在以往研究的基础上采用中年大鼠为实验动物，以强迫跑步结合普萘洛尔灌胃的方法建立中医心气虚证大鼠模型，着重探讨在心功能下降的基础上，模型大鼠脑内的胆碱能系统的变化，探讨“心主神明”的现代科学内涵。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　清结级SD雄性大鼠，14～16月龄，体重(600±30) g，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物合格证号：SIVX（沪）20030002；动物自由饮食与饮水，室温18～22℃，日光灯辅助照明，维持每日光照12 h。实验中，各组均有动物因疲劳、溺水等原因而死亡。正常组10只，其余组12只。

　　1.2 器材与试剂

　　六道动物跑台购自北京硕林苑科技有限公司，Morris水迷宫购自上海吉量软件科技有限公司；心得安片（盐酸普萘洛尔片）购自上海辛帕斯制药有限公司。

　　1.3 造模方法

　　采用强迫跑步结合灌服普萘洛尔的方法建立心气虚证大鼠模型〔1～3〕。大鼠在电动跑台上电刺激强迫跑步，跑步速度为21 m/min，刺激电压为70 V，刺激频率最大，以翻正反射消失为疲劳标准〔4〕。每天跑步一次，每周5 d，为期4 w，实验28 d后，第29天正常组与疲劳组灌胃给予2 ml生理盐水，小剂量组、中剂量组和大剂量组分别灌胃给予不同浓度（2.5、5.0、7.5 mg/ml）的普萘洛尔溶液2 ml，各组均连续灌胃5 d。

　　1.4 分组及给药

　　所有动物随机分5组：正常对照组（正常组）、疲劳对照组（疲劳组）、小剂量普萘洛尔+疲劳组（小剂量组）、中剂量普萘洛尔+疲劳组（中剂量组）和大剂量普萘洛尔+疲劳组（大剂量组）。将250、500、750 mg普萘洛尔片研成粉末溶于100 ml双蒸水制成小、中、大剂量的普萘洛尔溶液。

　　1.5 Morris水迷宫检测

　　水迷宫由上海市中医老年医学研究所提供，水迷宫圆形，直径1.6 m，平台直径12 cm。测试时平台置于水迷宫西南象限，水面高出平台1.5 cm，水温保持在19～20℃。大鼠连续测试5 d，每天测试时大鼠分别从水迷宫正北和正东两个点放入。设定最长游泳时间为70 s，用摄像探头记录大鼠找到平台的时间即潜伏期。

　　1.6 乙酰胆碱酯酶(AchE)检测

　　称取大鼠皮层组织重量，加9倍0.9％生理盐水，制备10％组织匀浆。采用羟胺比色法测定AchE活力，试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，严格按照试剂盒操作说明书进行，蛋白测定采用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.7 M受体Rt值检测

　　采用3HQNB为放射配基的单点结合分析法。3HQNB为Amersham公司产品，比放射性51.0 Ci／mmol。根据HQNB与膜受体蛋白结合得到的饱和曲线，在饱和区选取一配体浓度(1.5 nmol/L)作单点法的工作浓度，根据配体与膜蛋白复合物的放射性强度求得受体结合位点数。每管加3HQNB100 L和膜蛋白悬液200 μl，以反应缓冲液补足至400 μl。全部反应管在37℃水浴中振荡温育30 min，立即用多头细胞收集器以冰冷缓冲液终止反应，迅速抽滤至3层玻璃纤维膜上，并以冰冷缓冲液约10 ml淋洗，将结合部分收集于玻璃纤维滤膜上，滤膜于80℃烘干。将含结合物的干滤膜投入含闪烁液的小测量杯内，液体闪烁计数器测量放射性强度。脑膜蛋白定量采用Lowry法。

　　1.8 统计学处理

　　数据以x±s表示，应用SPSS11.5统计软件对数据进行统计分析。如果数据呈正态分布且方差齐，对组间比较进行方差分析；如果方差不齐则采用秩和检验进行数据分析。

　　2 结果

　　2.1 学习记忆检测结果

　　随着训练次数的增加，各组大鼠Morris水迷宫的潜伏期均有所缩短，说明学习记忆上均有不同程度的改善。与正常组比较，大剂量组在第3天的潜伏期有显著差异（P＜0.05），并在第4、5天均较空白组有延长的趋势。而其他各组与空白组比较均无显著性差异。见表1。表1 各组大鼠学习记能力的变化(略)

　　2.2 AchE活性

　　与正常组比较，疲劳组皮层部位的AchE未出现显著变化。小、中、大剂量组皮层部位的AchE均出现显著升高(P＜0.05)。提示皮层部位的胆碱能系统出现胆碱能功能的紊乱，随着AchE活力增高，使得乙酰胆碱(Ach)分解增加，从而造成学习记忆能力降低。见表2。

　　2.3 M受体Rt值变化

　　与正常组比较，疲劳组皮层部位的M受体Rt值未出现显著变化。小、中剂量组皮层部位的M受体Rt值未出现显著降低；大剂量组M受体Rt值显著降低(P＜0.05)。提示皮层部位M受体结合容量的降低，从而引起胆碱能功能紊乱，是造成大剂量组模型大鼠学习记忆能力降低的另一原因，见表2。表2 各组大鼠皮层部位AchE和M受体Rt值变化（略）

　　3 讨论
　　
　　中医学认为“心”作为五脏六腑之首，不仅仅承担了运送血液的动力泵的作用，更重要的是作为人体中的“君主之官”。《类经》曰：“心为一身之君主，禀虚灵而含造化，具理而应万机，脏腑百骸，唯所是命，聪明智慧，莫不由之，故曰神明出焉”，可见心在脏腑中起着最为重要的作用。同时心主神明是心主宰全身的重要途径，这一功能是通过心主血脉，及心气的正常传输得以实现。历代中医学家早已认识到心气不足对记忆和精神行为的影响。《医学心悟·卷四》曰：“心藏神，神明不充，则遇事遗忘也”，《巢氏病源·多忘候》曰：“多忘者，心虚也，心主血脉而藏于神”，《类证治裁·健忘证治》亦明确指出：“健忘者，陡然忘之，尽力思索不来也。夫人之神宅于心，心之精依于肾，而脑为元神之府，精髓之海，实记性所凭也”。心脏功能的低下，则造成气血不足，心气不足必然导致全身功能的下降，最终将导致神明失用。
　　
　　利用Morris水迷宫直接对大鼠的行为学进行测定，是一种评价大鼠空间记忆功能较为客观而准确的方法，具有操作相对简单的优点，同时通过摄像系统和计算机软件分析系统对数据进行量化分析，从而较为客观的反映动物的认知水平。在Moris水迷宫中，大鼠需要通过反复学习、认识迷宫周围标记的空间位置，寻找记忆里接近水迷宫中平台的最佳线路，用最短时间找到并爬上平台避免溺死。Morris水迷宫检测可以减少因为感觉、运动缺陷而对实验结果产生的干扰，其潜伏期能较为准确的描述动物的空间学习记忆能力，所以是目前较常采用的学习记忆测定方法。大鼠产生的记忆属于陈述性记忆，依赖于评价、比较和推理等认知过程，若大鼠的空间学习记忆能力明显下降，其潜伏期将延长〔5〕。在试验中，各组大鼠在一定时间内通过反复学习，依赖迷宫周围标记的空间位置，均可学会寻找平台，5 d的平均潜伏期均逐渐缩短，说明大鼠在学习记忆过程中逐渐熟练。但各组比较后显示，采用强迫跑步结合灌服大剂量普萘洛尔建立心气虚证大鼠模型寻找平台的潜伏期明显延长，第3
天较正常组出现明显的学习记忆能力减退。
　　
　　以往的实验结果表明，通过强迫跑步结合灌服大剂量普萘洛尔建立心气虚证大鼠模型，会出现心功能改变，主要为射血分数、心室短轴缩短分数的明显降低，从而降低脑部的血液供应〔6〕。本实验结果进一步显示，心气虚证动物模型会出现脑内胆碱能系统的变化，AchE酶活性增加、M受体Rt值降低，从而造成Ach量的不足，是造成学习记忆能力下降的原因之一。
　　
　　总之，本研究证实在心和脑之间有着密切的联系，心功能的降低可以引起脑部神经系统的生理功能出现紊乱，这对阐述中医“心主神明”理论的科学内涵提供了实验依据。

参考文献

　　1 程志清，龚文波，姚立，等.SD大鼠心气虚证动物模型的研制〔J〕.中国中医药科技，2003；10(6)：3613.

　　2 姚立，程志清，龚文波，等.强迫跑步法建立Wistar大鼠心气虚证模型〔J〕.中医药学刊，2004；22(1)：3941.

　　3 程志清，姚立，龚文波，等.Wistar大鼠心气虚证模型的建立与评价〔J〕.中国医药学报，2003；18(11)：6547.

　　4 Thomas DP，Marshall KI.Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures〔J〕.Int J Sports Med，1988;9(4)：25760.
　
　　5 柯尊记，姚志彬.空间学习记忆的行为模式及其分子神经生物学基础〔J〕.解剖科学进展，1998；4(1):17.

　　6 金红姝，林水淼，杨戈，等.心气虚证大鼠模型心功能变化的超声评价〔J〕.山东中医药大学学报，　2007；31(1)：757.