体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胆碱能样神经元

作者：井绪东 张洹 陈丽 何冬梅

【摘要】 　　目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞能否分化为胆碱能样神经元。方法 分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），取2～4代MSCs，进行诱导其向胆碱能神经元分化。诱导方案：10% 胎牛血清诱导2 d； 换液为DMEM/F12培养基，加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、巯基乙醇(ME)、维甲酸(RA)、神经生长因子(NGF)，诱导8 d；加入表皮生长因子(EGF)，肝素（Heparin）继续诱导8 d。空白对照组不作任何处理。观察诱导后的形态变化。采用RTPCR检测巢蛋白（nestin），核受体相关因子（Nurr1），胆碱乙酰转移酶（ChAT）mRNA 的表达，间接免疫荧光法检测表达 nestin、ChAT、神经核蛋白（NeuN)，乙酰胆碱酯酶(AchE) 的阳性细胞。结果 诱导后细胞形态逐渐由长梭形变为圆形或椭圆形，突起形成；RTPCR显示，诱导后的细胞高表达 nestin、Nurr1、ChAT，且基因表达相对强度与未诱导的MSCs比较有显著差异（P&<0.01）。免疫荧光法检测显示，诱导后的细胞高表达nestin、ChAT、NeuN、AchE，且阳性细胞大于80%，而对照组除ChAT 阳性细胞为1%外，其他均为阴性。结论 大鼠MSCs可诱导为胆碱能样神经细胞。

【关键词】 间充质干细胞；胆碱能神经元；大鼠； 生长因子

　　【Abstract】 Objective To explore the differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into cholinergic likeneurons by inducing reagents. Methods MSCs from rat bone marrow were isolated and purified by cell culture， which were induced and differentiated into cholinergic likeneurons with 2～4 generations of　MSCs by inducing reagents. The protocol was as follows: MSCs were incubated with 10% FBS for 2 days and then medium was replaced by DMEM/F12 complemented with 10 μg/L of bFGF， 0.1 mmol/L of 2ME， 1 mmol/L of RA， 10 μg/L of NGF for 8 days. And then 10 μg/L of EGF and 1 250 U/ml of heparin were added into the culture system for culture for 8 days. RTPCR and gel electrophoresis were used to detect gene expression of nestin， Nurr1， choline acetyltransferase (CHAT). Immunological fluorescent staining was used to measure nestin， CHAT， NeuN，acetylcholine esterase (AchE) positive cells. Results Induced cells gradually became from long shuttle into round or ellipse with neuronlike dendrite. RTPCR showed that the induced neuronlike cells expressed special neurocyte genes of nestin，Nurron，CHAT. Indirect immunological fluorescent staining showed positive cells with nestin，CHAT，NeuN，AchE reached 80% respectively. Conclusions MSCs from rat bone marrow can differentiate into cholinergic likeneurons.
　　
　　【Key words】 Mesenchymal stem cells; Cholinergic neuron; Rat; Growth factors

　　骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有向多种细胞系分化的潜能。近年来发现它还具有向神经细胞分化的潜能，为治疗神经损伤、帕金森病、早老性痴呆等神经退行性疾病带来了希望，是组织工程种子细胞〔1，2〕。就目前MSCs向神经分化研究而言，国内外大多数研究集中在MSCs在体内外分化为神经元样细胞及神经干细胞或胚胎干细胞向胆碱能神经元分化〔3，4〕，尚未见MSCs直接向特异性胆碱能神经元分化的系统报道。本实验探索MSCs能否定向诱导分化为特异胆碱能神经元，以期待MSCs最终应用于临床治疗上述多种神经系统疾病。

　　1 材料与方法
　
　　1.1 实验动物与试剂

　　8周龄SD大鼠购自广东省实验动物中心， SCXY（粤）20060015，体质量250～300 g，SPF级。DMEM/F12培养基(Gibco)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；2巯基乙醇（2ME），维甲酸（RA），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF），神经生长因子（NGF）(美国 PeproTech)；胆碱乙酰化转移酶（ChAT）一抗(羊抗大鼠，Chemicon)；乙酰胆碱酯酶(AchE)一抗（兔抗大鼠）、巢蛋白（nestin）一抗（兔抗大鼠）、神经核蛋白（NeuN）一抗（小鼠抗大鼠）均购自武汉博士德；CY3标记二抗IgG(兔抗羊，Sigma，为易于区分记为CY3a)、 CY3标记二抗IgG(羊抗兔，Sigma，记为CY3b)、 FITC标记二抗IgG（大鼠抗小鼠，Sigma）；RTPCR试剂盒（Takara）。

　　1.2 大鼠MSCs的分离和传代

　　SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取股骨，用10%FBS冲出骨髓，以（1～2）×109/L细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，加入10%FBS的DMEM/F12培养液，4～5 d后换液，以后每隔3～4 d换液1次。待80%～90%融合后，以0.25%的胰酶消化传代。

　　1.3 MSCs定向诱导分化为胆碱能神经细胞

　　将2～4代的MSCs，接种在铺有多聚赖氨酸盖玻片的6孔板中。实验组给予10%FBS + 10 μg/L bFGF诱导2 d后，换液为DMEM/F12后分为两步进行，先加入10 μg/L bFGF、0.1 mmol/L 2ME、1 mmol/L RA、10 μg/L NGF继续诱导8 d(Ⅰ组) 2～3 d换液1次。第二步，在上述的基础上加入10 μg/L EGF、1 250 U/ml 肝素（Heparin）继续诱导8 d（Ⅱ组），2～3 d换液1次。空白对照组不作任何处理。

　　1.4 目的基因mRNA表达RTPCR检测

　　各组于诱导5 d后取部分盖玻片，Trizol法提取mRNA，各取总RNA 约1 μg，以表1所示各自特异引物，以βactin为内参照，行RTPCR扩增；按TAKARA试剂盒说明，配成50 μl的反应体系，95℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，扩增40个循环，PCR产物行琼脂糖凝胶电泳分析。

　　表1 目的基因及内参上下游特异引物序列

　　1.5 分化细胞间接免疫荧光的检测

　　3组细胞分别于诱导5 d后取出盖玻片，以100%丙酮固定10 min，0.1% Triton X100 作用15 min，非免疫动物血清37℃孵育30 min，分别加一抗ChAT(1∶100稀释)， NeuN抗（1∶50稀释），AchE一抗（1∶60稀释），nestin一抗(1∶100稀释)， 4℃过夜后分别加入相对应荧光素标记的二抗CY3a、FITC、CY3b，37℃孵育30 min，核染料Hochest33258 37℃孵育5 min，于荧光显微镜下进行观察，计数ChAT阳性的分化细胞。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

　　1.6 统计学处理

　　统计学处理采用SPSS13.0 软件，间接免疫荧光检测各组间的胆碱能神经细胞分化率比较使用χ2检验，结果用χ2值表示；目的基因相对表达强度使用两样本均数的独立样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 骨髓MSCs 镜下观察

　　细胞接种72 h后，大部分细胞贴壁，并延伸呈现成纤维样细胞形态，呈梭形，细胞核较大、扁圆形。以后细胞逐渐增多。至第5、6天出现多个细胞组成的细胞克隆，15～20 d细胞融合成单层，排列有一定的方向性。传代的细胞迅速贴壁，融合后都呈梭形。

　　2.2 骨髓MSCs 向神经元样细胞分化的形态学观察

　　两实验组诱导1、3 d后部分梭形细胞开始变圆，伸出突起，但细胞突起小而少，大部分细胞孤立存在，细胞间隙增宽，仅少部分分化细胞通过突起连接，但团块小，分化细胞大小不一，胞浆颗粒细密；5 d后胞间紧密及突起连接增加，浆内颗粒增粗变大并可见部分囊泡颗粒聚集于突起开口或突起内，分化细胞团块聚集倾向明显，形成神经球样结构。10 d后分化细胞率增加，胞浆及突起内囊泡颗粒继续增加，突起增粗，胞外基质也可见分泌颗粒，细胞的立体感及折光性增强。

　　2.3 骨髓MSCs 向神经元样细胞分化基因表达分析

　　RTPCR和琼脂糖凝胶电泳显示，两实验组诱导5 d后均出现nestin、Nurr1、βactin的mRNA条带见图1。βactin为一管家基因，在活细胞中稳定表达，以其为参照。实验Ⅰ、Ⅱ组 Nestin的基因表达强度分别为0.927±0.103、1.065±0.096，组间比较差异有统计意义(P=0.000，t=-23.98)；实验Ⅰ、Ⅱ组Nurr1的基因表达强度分别为1.383±0.166、0.958±0.012，组间比较差异有统计意义(P=0.000
，t=51.33)。见图1。

　　2.4 骨髓MSCs 向神经元样细胞分化的蛋白表达分析

　　实验组出现不同数量的神经分化细胞，胞浆及突起内同时表达神经干细胞标志nestin蛋白，胞核内可见表达成熟的神经元标记物神经特异核抗原NeuN蛋白。阴性对照组细胞的胞浆无荧光。Ⅰ组nestin、NeuN的阳性率分别为52.8%、68.6%；Ⅱ 组nestin、NeuN的阳性率分别为75.2%、65.1%。统计分析结果显示：两组间nestin、NeuN的阳性率比较均无统计学显著性差异（P&>0.05）。 见图2。

　　2.5 诱导骨髓MSCs向胆碱能神经元样细胞定向分化

　　两实验组诱导5 d后均出现ChAT mRNA条带见图1。实验Ⅰ、Ⅱ组ChAT的基因表达强度分别为1.320±0.396、0.940±0.006，组间比较差异有统计意义(P=0.000，t=-22.11)。免疫荧光示：胞浆及突起内可同时表达胆碱能神经元特异标志物ChAT、乙酰胆碱分解代谢酶AchE，见图2。统计显示，空白对照组、实验Ⅰ、Ⅱ组ChAT阳性率分别为1.6%、71.4%、59.1%，三组间差异明显（P=0.000，χ2=401.7）；而两实验组差异无统计意义（P&>0.05），实验Ⅰ、Ⅱ组AchE阳性率分别为83%、90%，两组间也无统计学差异（P&>0.05）。

　　3 讨论
　　
　　本研究发现，在无血清的DMEM/F12中加入2ME、RA、bFGF、EGF、NGF、Heparin等试剂，可诱导间充质干细胞分化为胆碱能神经样细胞。实验还发现诱导5 d的MSCs不仅表达nestin、Nurr1、NeuN神经元标志物，而且也表达胆碱能神经元特异标志物乙酰胆碱合成的关键酶胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱分解代谢关键酶胆碱酯酶。以上结果提示：经上述方案诱导后，MSCs已分化成为胆碱能样神经细胞。本研究显示，加入了EGF及Heparin的实验Ⅱ并没有比Ⅰ增加阳性细胞分化率，推测可能EGF主要刺激胶质前体细胞增殖〔5〕，促使NSCs（神经干细胞）存活和增殖，在NSCs增殖后期发挥作用〔6〕。而对促分化成熟作用不明显相关，基因表达强度分析示，实验Ⅱ组nestin 表达强度高于实验Ⅰ组，而Nurr1及ChAT低于实验Ⅰ组也证实了这一点，即EGF诱导组神经干细胞相对增加，而逐步趋向成熟的前体细胞及分化成熟细胞的比例相对减少。
　　
　　实验发现，单用bFGF诱导1 d的MSCs也呈现大于20%的形态分化率，提示其具有不依赖其他诱导剂的单独作用。Zhang等〔7〕研究发现：bFGF与神经节苷脂（GM1）可协同促进间充质干细胞分化成神经细胞及星形胶质细胞。bFGF能促进神经元前体细胞的存活或使神经干细胞向神经元前体细胞分化增殖，从而导致NSCs分化为神经元的比例增多，许多物种的神经系统都有bFGF表达，bFGF能维持神经元的存活，刺激海马神经元的轴突生长，维持神经干细胞的自我复制能力〔8〕。Androutsell发现，通过渗透泵向正常大鼠脑内注入bFGF未见细胞分裂增加，但作者又发现向大脑中动脉栓塞皮质缺血大鼠脑内输入bFGF+Dll4可使SVZ（脑室下区）细胞分裂增加，并于45 d后改善其行为能力〔9〕，提示组织损伤可能为神经细胞分化条件之一。
　　
　　抗氧化剂2ME可正性调节ChAT活性〔10〕，其可促进未成熟细胞即干祖细胞的存活，增加其分化概率，对成熟细胞无此效应，对干细胞的选择可能是非必要的，仅在前体细胞阶段发挥作用。其可能通过增加谷胱甘肽含量发挥抗氧化作用，而改善基质环境，诱导神经细胞突起形成，诱发其表型形态学发生，但并不能改变干细胞的定向分化比例，2ME+NGF对ChAT的诱导作用大于2ME〔11〕，可释为2ME增加神经前体细胞数量以便有更多的干细胞应答NGF促进其向胆碱能神经元分化。
　　
　　RA是一种强诱导分化剂，可直接进入细胞内与其核受体结合作为反式作用因子调控特异基因表达；能显著提高间充质干细胞的RA受体和ICAM1（细胞间黏附因子）的表达，在体内RA对胆碱能神经系统的发生、发育起重要作用。实验中，我们发现细胞聚集现象及神经球结构形成，可能与神经前体细胞分泌合成一些黏附因子有关，钙黏蛋白，β连环蛋白，a连环蛋白在介导神经前体细胞之间的黏附过程中发挥主要作用。而Heparin，多聚赖氨酸也可能参与此进程，实验Ⅱ组（包含Heparin）神经球结构较大也验证了这一点。这些黏附因子与基质也可能参与细胞增殖分化调控过程。此外Heparin作为蛋白聚糖可结合诱导因子，可提高这些因子作用的稳定性。

　　总之，本研究初步证明了诱导MSCs向胆碱能神经元分化的可行性，为进一步研究提供资料。

参考文献

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