丙酮酸氧化酶速率法在大批量献血员ALT检测中的应用

【摘要】 目的：丙酮酸氧化酶速率法适用于大批量献血员ALT的检测。方法：利用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢，过氧化氢与2，4，6三溴-3-羟基苯甲酸（TBHBA）和4-氨基氨替比林（4-AAP）在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物。结果：该方法线性范围达200 U/L，与紫外酶偶联速率法比较，相关系数r=0.991，y=1.072x＋1.032，n=90。结论：该方法操作简单、快速，结果准确，灵敏度高，重复性好，特别适合血站大批量献血员ALT检测。

【关键词】 献血员；ALT；丙酮酸氧化酶速率法

目前，各级血液中心、血站常用的丙氨酸氨基转移酶(ALT)简称转氨酶检测方法有赖氏法、速率法、酮体粉法，但由于赖氏法(60 min)反应时间较长，酮体粉法准确性差，速率法对仪器要求较高等特点，均不适用于基层血站大规模的无偿献血活动[1]。我站自2005年以来用丙酮酸氧化酶速率法，该方法使用基层血站必备的酶标仪即可，而且操作简单、快速，具有较高的准确性和精密度，非常适合基层血站大批量献血员ALT的控制。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器

　　酶标仪（Multiskan MK3，芬兰Labsystems公司），TDA40FA全自动生化分析仪（日本东芝公司）。

　　1.2 试剂

　　ALT/GPT试剂盒（江西瑞华倍肯医学制剂有限公司，批号20050921，20060205）。

　　1.3 质控血清

　　江西瑞华倍肯医学制剂有限公司提供，经全自动生化分析仪确认，低值血清(L)：51 U/L，高值血清(H)：103 U/L。

　　1.4 反应原理

　　L-丙氨酸＋α-酮戊二酸ALT丙酮酸＋L-谷氨酸，丙酮酸＋O2＋P丙酮酸氧化酶h3O2＋乙酰磷酸，h3O2＋4-AAP＋TBHBA过氧化物酶红色醌类化合物。

　　1.5 测定方法

　　取96孔酶标板上，A1孔为试剂空白、B1孔为标准，C1及D1孔为质控，A2～H12孔为测定。于A1孔内加蒸馏水20 μL，于B1孔内加标准血清20 μL；C1及D1孔分别加低值及高值质控血清20 μL；A2～H12孔内分别加受检血清20 μL，然后各孔加工作液200 μL，混匀，置37 ℃反应10 min时第一次比色吸光度为A1及13 min时第二次比色吸光度为A2(用双时测量模式即二点测量模式)，主波长为492 nm，次波长为620 nm，计算各孔吸光度之差值(A2-A1)。ALT活性(U/L)=测定孔吸光度/标准孔吸光度×标准血清(U/L)

　　2 结果与讨论

　　2.1 线性

　　取1份ALT活性200 U/L的血清，用生理盐水稀释为不同浓度按本法操作，结果在200 U/L内呈线性。详见表1。表1 ALT活力测定值（略）

　　2.2 方法比较

　　选择检测生化常规标本90份，分别用本法(y)和日本东芝TDA40FA全自动生化分析仪紫外酶偶联速率法(x)用上海久强试剂盒测定血清ALT，两法相关系数为r=0.991，y=1.072x＋1.032。

　　2.3 精密度

　　取2份低值、高值质控标本，批内重复测定20次，低值标本=51 U/L，SD＝1.1，CV＝2.1 %；高值标本 ＝103 U/L，SD＝2.0，CV＝1.94 %。批间重复，将标本存4 ℃冰箱，每天重复测定4次，共测定20次，低值标本=51 U/L，SD＝1.5，CV＝2.9 %；高值标本＝103 U/L，SD＝2.9，CV＝2.8 %，显示该方法的精密度和重复性较好。

　　2.4 反应稳定性

　　上述90份标本，在37 ℃反应10 min后，进行3 min、4 min、6 min、8 min、10 min、13 min、15 min、17 min测定，发现3 min、4 min、6 min测得的结果基本不变，8 min以后值偏低，说明第二次显色结束，3～6 min内比色结果可靠。

　　2.5 酶反应试剂稳定性

　　酶反应试剂于4 ℃保存，可使用2周，酶活性测定结果不变。

　　2.6 干扰因素的消除

　　(1)该法主波长为492 nm，次波长为620 nm，使用双波长可有效克服溶血、脂血的干扰[2]。(2)该法为获取反应10 min与13 min内两个时间点内的差值，可有效抵消溶血、脂血的影响。

　　3 结论

　　丙酮酸氧化酶速率法与紫外偶联速率法有很好的相关性，且仪器要求较低，大大降低了实验成本，非常适合血站大规模地检测献血员ALT。

参考文献