锁阳提取物对衰老模型鼠免疫功能及自由基代谢的影响

　　　　 作者：刘永琦， 苏韫， 吴建军， 张毅， 魏舒畅， 聂蕾， 颜春鲁

【摘要】 　　目的: 通过实验探索锁阳多糖、 水提取物咀嚼片延缓衰老的效应及其作用机制。方法: 提取锁阳多糖、 水提取物并制备其咀嚼片; 制备衰老动物模型， 观察该制剂对衰老模型动物免疫吞噬功能、 脾淋巴细胞对刀豆蛋白A（ConA）刺激的增殖活性等的影响; 对衰老模型动物脑超氧化物歧化酶(SOD)活性、 丙二醛(MDA)、 一氧化氮（NO）含量的影响。结果: 锁阳咀嚼片治疗组吞噬指数、 吞噬百分率、 脾脏淋巴细胞转化能力较衰老模型动物升高; 锁阳咀嚼片能提高衰老模型动物脑组织SOD活性， 降低MDA、 NO的含量， 且锁阳多糖组在改善自由基水平方面优于锁阳水提物组。结论: 锁阳多糖、 水提取物咀嚼片可通过改善衰老模型动物免疫功能以及影响脂质过氧化物作用发挥抗衰老作用。

【关键词】 锁阳; 衰老; 免疫; 自由基

　　现代医学认为， 衰老的发展与神经系统、 免疫系统机能的减退， 自由基代谢、 细胞凋亡失常等密切相关［1］。中医学认为脾肾两虚、 夹瘀夹痰是衰老的主要机制之一［2］。本研究中， 我们探讨了锁阳咀嚼片延缓衰老的效应及其作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 78X2型片剂四用测定仪、 酶联免疫检测仪、 CO2培养箱、 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、 丙二醛（malondialdhyde， MDA）、 一氧化氮（nitric oxide， NO）测试盒均由南京建成生物工程研究所提供、 RPMI1640购于GibcoBRL公司、 小牛血清为Hyclone公司产品、 刀豆蛋白A（ConA）为Sigma公司产品、 二甲基亚酚购于宝泰克公司、 四甲基偶氮唑盐(MTT)为Fluka AG公司产品、 D半乳糖(Dgal)购于上海恒信化学试剂有限公司、 其余试剂均为国产分析纯; Wister大鼠（质量150～160 g）、 昆明种小鼠（质量20～22 g）， 均由甘肃中医学院FPF实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 锁阳水提醇沉物咀嚼片制备 锁阳加水回流提取2次。第1次加10倍量水， 时间1.5 h; 第2次加水6倍量， 时间1.0 h， 提取温度100℃， 合并2次提取液。常压浓缩至生药1 g/mL（药液）， 加乙醇至50％静置24 h。滤过， 滤液回流乙醇浓缩至稠膏状（D1.40）， 60℃常压烘干。粉碎至40目， 加入乳糖、 甘露醇。提取物∶乳糖∶甘露醇比例为3∶1∶1， 湿法制粒压片（1 g相当于3.3 g生药， 成人量7.8 g/d）。

　　1.2.2 锁阳多糖咀嚼片制备 锁阳加水回流提取2次。第1次加10倍量水， 时间1.5 h; 第2次加水6倍量， 时间1.0 h， 提取温度100℃， 合并2次提取液。常压浓缩至生药1 g/mL（药液）， 加乙醇至30％静置24 h， 滤过; 滤液继续加乙醇至80％静置24 h， 滤过， 得沉淀多糖粗提物， 80℃常压烘干。粉碎至80目， 加入乳糖、 甘露醇。提取物∶乳糖∶甘露醇为3∶1∶1， 湿法制粒压片（1 g相当于11.2 g生药， 成人量2 g/d）。

　　1.2.3 小鼠衰老模型的复制 昆明种小鼠60只， 随机分为空白对照组、 模型组、 维生素E（VE）组、 中药1组（多糖）、 2组（水提物）组， 每组12只。除空白组外， 参照文献复制模型［3］， 即每日皮下按120 mg/kg的剂量注射Dgal溶液0.5 mL， 连续注射7周。

　　1.2.4 大鼠衰老模型的复制 Wister大鼠40只， 如前随机分为5组， 每组8只。除空白对照组外，

参考文献

复制衰老模型［3］， 即每日皮下按120 mg/kg的剂量注射Dgal溶液0.5 mL， 连续注射7周。

　　1.2.5 动物给药方法 中药1、 2组分别灌服相应锁阳多糖、 水提物咀嚼片0.25 g/(kg·d)、 1.00 g/(kg·d)， VE组给予VE混悬液25 mg/(kg·d)灌胃（VE使用前加蒸馏水以超声震荡仪制成混悬液）， 空白对照组与单纯模型组给予等体积生理盐水， 均灌服连续6周。

　　1.2.6 对衰老模型小鼠免疫吞噬功能的影响 6周给药末次1 h、 24 h后， 分别在小鼠腹腔注射1 mL淀粉肉汤; 再1 h后给腹腔注射1%鸡血球1 mL。1 h后用注射器抽取腹腔渗出液作涂片， 用瑞特氏染液进行染色， 检测其吞噬百分率、 吞噬指数。

　　1.2.7 ConA刺激衰老模型大鼠脾淋巴细胞增殖活性测定（MTT法） 6周后各组大鼠无菌取脾， 在超净工作台将脾剪碎， 经300目筛网过滤， 用含双抗（青霉素+链霉素）PBS液洗3次， 并用RPMI1640培养液(含100 mL/L小牛血清、 青霉素、 链霉素、 丙酮酸钠、 β巯基乙醇)调整细胞的密度为1×109/L。加入96孔培养板中， 每孔0.1 mL， 各组分装复孔作为平行样， 依次加浓度为100 mg/L、 50 μL ConA液(相当于5 mg/L)， 并设对照孔（不加ConA）， 置50 mL/L， 37℃培养72 h。培养结束前4 h， 加入MTT(5 g/L)50 μL/孔， 继续培养4 h后， 每孔加入0.1 mL二甲基亚砜， 过夜完全溶解紫色结晶后， 每孔用酶联免疫检测仪， 以570 nm波长测定光密度值。采用单因素方差分析比较各试验组与对照组的差异。各孔光密度值减去对照孔光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。

　　1.2.8 对衰老模型大鼠脂质过氧化作用的影响 无菌取大脑制备100 mg/L组织匀浆。以3 000 r/min离心10 min， 取上清液进行标本测定。MDA含量、 SOD、 NO水平的测定参照相应试剂盒说明书进行。

　　1.2.9 统计学分析 所有结果采用x±s表示。对衰老模型动物免疫功能的影响各项指标分别采用多组资料两两比较的秩和检验进行比较; 对衰老模型大鼠脂质过氧化作用影响指标采用单因素方差分析进行统计分析。所有数据用SPSS13.0 for Windows统计软件处理。

　　2 结果

　　2.1 衰老模型小鼠免疫吞噬功能的影响 由表1可看出， 衰老模型组小鼠吞噬指数、 吞噬百分率较空白组下降（P&<0.05）， 中药治疗组上述指标比衰老模型明显升高（P&<0.05）。

　　表1 对衰老模型小鼠吞噬指数、 吞噬百分率的影响（略）

　　aP&<0.05 vs正常对照组; cP&<0.05 vs衰老模型组.

　　2.2 衰老模型动物脾脏淋巴细胞转化试验能力的影响 由表2可看出， 衰老模型组脾脏淋巴细胞转化能力比空白对照组大鼠下降（P&<0.05）; 治疗组大鼠脾脏淋巴细胞转化能力比模型组大鼠升高（P&<0.05）。

　　表2 对衰老模型动物脾脏淋巴细胞转化试验能力的影响（略）

　　aP&<0.05 vs正常对照组; cP&<0.05 vs衰老模型组.

　　2.3 大鼠SOD、 MDA、 NO含量的水平变化 由表3可看出， 衰老模型大鼠脑SOD活性明显较正常组下降， MDA、 NO含量增多（P&<0.05）。与模型组比较， 锁阳提取物组脑SOD含量明显升高， 脑MDA、 NO含量明显降低（P&<0.05）。锁阳多糖组在改善自由基水平方面优于锁阳水提物组（P&<0.05）。

　　表3 各组大鼠脑组织SOD、 MDA、 NO含量的比较（略）

　　aP&<0.05 vs正常对照组; cP&<0.05 vs衰老模型组; eP&<0.05 vs锁阳水提物组.

　　3 讨论
　　
　　锁阳性甘、 温， 具补肾、 助阳、 益精等功能。现代医学从化学、 药理及临床等方面均研究证明锁阳具有调节免疫内分泌、 抗衰老、 改善性机能等多种生理活性， 是治疗老年性疾病、 延缓衰老的理想药物［4］。基于既往研究成果本课题组， 研制并开发的锁阳咀嚼片， 具有以下优势: 在有效成分的提取方面， 分别提取锁阳多糖以及水提醇沉物作为主要研究成分， 通过比较研究， 筛选出更为有效的药效成分进行提取; 在剂型方面， 选用咀嚼片， 明显提高药物的生物利用度， 具有稳定性好， 适用人群范围广等优势。VE是临床常用的抗衰老药物， 已经证实VE可以明显拮抗自由基引起的损伤， 对Dgal亚急性中毒拟衰老鼠模型氧自由基及血液生化指标的的异常改变也具有明显的改善作用［3］， 故本实验中选用VE作为对照药观察锁阳提取物的抗衰老作用。
　　
　　研究表明老年人的免疫功能的衰退， 最突出的是T、 B细胞的功能减退， 对非特异性有丝分裂原PHA、 ConA及外来抗原反应性降低， 导致免疫功能下降， 易发生感染［7， 8］。本实验研究表明， 衰老模型组吞噬指数、 吞噬百分率、 脾脏淋巴细胞转化能力较正常对照组下降（P&<0.05）， 提示衰老模型复制成功。锁阳咀嚼片治疗组吞噬指数、 吞噬百分率、 脾脏淋巴细胞转化能力较衰老模型动物明显升高（P&<0.05）。提示锁阳咀嚼片能较好改善衰老动物的免疫功能。
　　
　　在正常生理情况下， SOD通过歧化体内超氧阴离子自由基， 生成过氧化氢， 由过氧化氢酶清除， 阻止了对机体组织细胞的毒性氧化损伤; 但SOD随增龄而下降， 体内清除O-2等的能力下降， 引发脂质过氧化的一系列连锁反应， 从而产生各种生理 紊乱、 病理改变。O-2与NO往往产生在同一生物体系， 二者能相互反应， 形成氧化能力更强的过氧亚硝酸根(ONOO-)， 继而对机体产生更大的细胞毒性; 脂类极易在活性氧的攻击下产生快速氧化作用而产生MDA， 它与蛋白质或核酸交联后就形成脂褐素(LPF)。MDA、 LPF是脂质过氧化的产物， 其含量的变化间接反应了氧自由基的含量［9， 10］。本实验研究发现， 衰老模型小鼠脑、 血中SOD活性明显较正常组下降， 而MDA、 NO含量明显增多， 表明本实验用D半乳糖诱导的小鼠动物模型基本成功。锁阳咀嚼片治疗后能明显提高衰老模型动物脑组织SOD活性， 降低MDA、 NO的含量， 表明锁阳咀嚼片可提高体内抗氧化能力、 降低NO的含量， 起到延缓衰老的作用， 且锁阳多糖组在改善自由基水平方面优于锁阳水提物组。

参考文献

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　　［3］ 曹湘博， 西 月， 王艳春， 等. 维生素E对D半乳糖亚急性中毒拟衰老模型鼠氧自由基及相关生化指标的影响［J］. 中国老年学杂志， 2007， 27（7）: 1335-1338.

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　　［5］ 赵晓宏， 陈迪华， 斯建勇， 等. 多指标综合评分法研究中药新药片剂成型处方［J］. 中成药， 2002， 2(8): 579-581.

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　　［7］ CunninghamRundlesS. The effect of aging on mucosal host defense［J］. J Nutr Health Aging， 2004， 8(l): 20-25.

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　　［9］ Albina JE， Cui S， Mateo RB， et al. Nitric oxidemediated apoptosis in murine peritoned macrophages［J］. J Immunol， 1993， 150(1): 5080-5085.

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