兔抗人PON2抗体的制备与初步应用

【摘要】 目的: 制备兔抗人PON2 (paraoxonase2) 的多克隆抗体并进行初步鉴定。方法: 生物信息学方法分析人PON2蛋白序列， 选取人兔同源性较低， 亲水性及免疫原性较强的片段， 通过大肠杆菌原核表达系统进行重组表达， 获得GSTPON2融合蛋白用于免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体， 通过XX方法分离纯化得到的抗PON2多克隆抗体， 用Western blot、 间接免疫荧光对其进行特异性及灵敏度鉴定。结果: 成功获得了高表达的相对分子质量(Mr)为46 000的PON2重组融合蛋白; Western blot鉴定结果显示此多克隆抗体可特异识别肝脏总蛋白、 HeLa细胞及U937细胞中Mr为39 000的天然PON2蛋白; 间接免疫荧光结果显示此多克隆抗体所识别的蛋白定位于SY5Y细胞胞质中。结论: 抗人PON2的多克隆抗体特异识别肝总蛋白、 HeLa细胞及U937细胞中的天然蛋白， 可用于PON2的研究及临床检测。

【关键词】 PON2 多克隆抗体 重组抗原

　　人类PON（paraoxonase， 对氧磷酶）基因家族有3个成员: PON1、 PON2和PON3， 它们在染色体长臂7q21.3-22.1上按照着丝粒PON1PON2PON3端粒的顺序排列。在哺乳类动物中， 3个基因高度保守， 在不同种属间， 氨基酸水平上大约有79%～95%的同一性， 核苷酸水平上约有81%～95%的同一性［1］。PON1、 PON3表达主要受限于肝脏， 而PON2在大部分组织中都有表达， 如: 脑、 肝、 肾及睾丸组织［2］。系统进化分析显示PON2是家族中最古老的成员。PON2主要在肝脏中合成， 它能水解多种有机磷杀虫药的毒性代谢产物， 并且能水解广谱的有机磷酸酯底物和许多芳香羧酸酯。此外， PON2还有抗氧化功能， 防止LDL脂质过氧化， 并且能够反转氧化LDL的氧化作用。PON2的同质异构体与许多的病理生理条件有关， 包括: 与原生质脂蛋白的变更， Ⅱ型糖尿病的葡萄糖水平， 新生儿出生质量和冠心病的危险率［3-6］等现象有关。最近发现， PON基因家族与细胞的不对称分裂也有密切的关系， 在细胞不对称分裂中各种因素导致干细胞既有自我更新能力， 又能生成继续分化的细胞。在导致细胞不对称分裂的因素中， 命运决定子起着重要作用， 而PON作为Numb配体在果蝇的干细胞样成神经细胞的不对称分裂中发挥重要作用， Numb抑制自我更新， 且能被分配到注定分化的细胞中， 而Numb的分配依赖于它与PON的相互作用， 且PON在有丝分裂期间已呈不对称分布。由此可见PON对于细胞的不对称分裂研究具有重要意义。本研究中， 我们以PON2为切入点， 应用重组表达的PON2融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体， 并对抗体的特异性进行了鉴定， 这为进一步研究PON2在代谢及内分泌方面疾病， 不对称分裂中的作用奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)菌株为本实验室保存。pGEX４T1表达载体购于GE公司， pET32a表达载体购于Novagen公司。PCR回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购于Omega公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于PIERCE公司。ExTaq酶、 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购于日本TaKaRa公司。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购于Sigma公司。PVDF膜、 ECL反应试剂盒购于Amersham公司。羊抗兔IgGHRP， FITC羊抗兔IgG、 Hochest染核试剂、 羊血清封闭液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。扩增PON2部分片段的特异性引物由北京英骏生物公司合成。其上游引物序列为: 5′CGGGATCCATGACAGTCAAACATGAGCTTCTTCCAAG3′， 下游引物序列为: 5′CCGCTCGAGTTAGAGTTCACAATACAAGGCTC3′， 下划线部分为BamH I和Xho I的酶切位点。免疫用新西兰大耳白兔（雌性， 2 kg， 120 d）由军事医学科学院实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PON2重组蛋白的原核表达及纯化 搜索PON2的蛋白序列(Human Protein Reference Database， www.hprd.org)， 应用 DNAstar分析软件分析其亲水性， 疏水性及可能的抗原表位， 利用美国国立数据库（ncbi）的blast功能进行不同种属蛋白的同源性分析。选取同源性得分较低， 亲水性及免疫原性得分较高的片段进行重组表达。PCR扩增所用模板为PON2的cDNA (由北京蛋白质组研究中心蛋白相互作用实验室惠赠)， PCR产物经回收后， 直接用BamH I和Xho I双酶切， 酶切产物分别与表达载体 pGEX４T1 和 pET32a连接， 连接产物转化至感受态DH5α中， 涂板后37℃培养过夜， 次日挑取单克隆， 接种于含（0.1 g/L）氨苄西林的LB培养液中， 37℃震荡培养至A值约为0.3， 用10 μL PCR体系进行阳性克隆的鉴定， PCR鉴定阳性的克隆进行测序。测序正确后抽提pGEX４T1PON2 和 pET32aPON2质粒， 并转化入E.coli BL21（DE3）进行IPTG诱导表达。pGEX４T1PON2 和 pET32aPON2质粒在E.coli BL21（DE3）中均为包涵体表达， 菌体经超声波破碎后， 采用常规包涵体纯化法纯化， 纯化的包涵体溶解于8 mol/L尿素中， BCA法及SDSPAGE法进行蛋白的定量及纯度分析。

　　1.2.2 GSTPON2融合蛋白的Western blot分析 将重组菌菌体蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后， 点转移至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后， 加入1∶2 000稀释的鼠抗GST mAb， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显影。

　　1.2.3 兔抗人GSTPON2多克隆抗体的制备 取1.6 mg 纯化的GSTPON2重组蛋白溶于1 mL生理盐水中， 并与等体积福氏完全佐剂混合进行充分乳化， 取2只新西兰大耳白兔进行背部及腹股沟皮下多点注射， 每只兔子免疫1 mL抗原及佐剂混合物， 4周后蛋白剂量减半进行第2次免疫， 4周后进行第3次免疫， 免疫剂量为800 μg/只， 第3次加强免疫后10 d进行颈动脉取血， 分离血清。获得后的血清用HisPON2重组蛋白进行特异性的监测。

　　1.2.4 抗血清的纯化 兔血清用60 mmol/L的醋酸钠缓冲液稀释3～4倍， 0.1 mol/L NaOH调PH至4.5。缓慢滴加辛酸至浓度为25 mL/L， 温柔搅拌30 min后， 4℃， 10 000 g离心30 min， 弃沉淀， 上清用滤纸过滤后加入1/10体积10×PBS缓冲液， 调pH至7.4， 在搅拌条件下缓慢加入预冷的饱和硫酸铵溶液至45%的饱和度， 4℃沉淀过夜。次日于4℃、 3 000 g离心30 min， 弃上清， 用1×PBS缓冲液溶解沉淀。得到的溶液即为纯化的抗体， 对1×PBS缓冲液透析过夜。透析后抗体用SDSPAGE法检测纯度， BCA蛋白浓度测定试剂盒进行抗体的定量分析。

　　1.2.5 多克隆抗体的鉴定 （1）Western blot分析: 取正常人肝组织匀浆， 用RIPA 裂解液（10 mL/L NP40， 150 mmol/L NaCl， PBS pH7.2， 2 mmol/L， EDTA， 50 mmol/L 氟化钠， 0.2 mmol/L钒酸钠， 蛋白酶抑制剂1∶50）裂解。冰上孵育30 min 后， 13 500 g 离心45 min， 获得正常人肝组织裂解液。HeLa细胞及U937细胞待细胞密度达到约2×107时， 用上述方法处理获得细胞裂解液。上述3种蛋白各取24 μg加入等体积的2×SDS加样缓冲液， 100℃加热15 min， 进行常规SDSPAGE 电泳， 电泳后， 蛋白转移至PVDF膜上， 用50 g/L脱脂奶粉封闭后; 加入50 mg/L纯化的GSTPON2多抗， 室温下孵育1 h， TBST 洗膜后， 加入1∶20 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG， 室温孵育1 h， TBST 缓冲液洗膜后， ECL法显影分析。（2）间接细胞免疫荧光分析: 于6孔板中放入灭菌载玻片， 每孔接种1×105的SY5Y细胞（神经母细胞瘤细胞）， 待细胞爬片后培养48 h， 40 g/L 多聚甲醛（10 mL/L Triton）固定10 min; 空气干燥5 min; PBS 清洗标本3次， 各2 min; 羊血清（用1×PBS 按1∶10稀释）37℃ 封闭30 min; 加入30 mg/L纯化的多抗作为一抗， 4℃孵育过夜; 次日PBS清洗标本3次， 吹干; 滴加1∶200稀释的 FITC羊抗兔 IgG， 室温孵育30 min; PBS 洗3次; 滴加Hochest染核试剂（用1×PBS 按1∶5 000稀释）， 室温孵育30 min， PBS 洗3次; 800 mL/L 甘油封片， 镜检拍照。

　　2 结果

　　2.1 PON2重组蛋白的原核表达及纯化

　　2.1.1 PON2的生物信息学分析 为了有效获得高效价， 高特异性的多克隆抗体， 我们对PON2全长蛋白序列与家兔的PON2蛋白进行了同源性分析， 结果发现靠近C端的片段与兔的同源性较低。我们又用DNAstar软件对蛋白的亲水性及可能的抗原表位进行了分析， 根据亲水性、 免疫原性、 灵活性及柔韧性及同源性等的分析， 最后选取157354位氨基酸进行下一步的克隆表达。

　　2.1.2 PON2基因的PCR扩增 用PON2 cDNA作为模板扩增目的片段， 结果见图1， 在594 bp处有1条特异的扩增条带， 片段大小与预期值一致， 表明PCR特异性好， 扩增成功。将扩增后目的片段分别连接入pGEX４T1 和 pET32a 载体， 并转化入DH5α中， 菌液PCR鉴定结果显示插入片段大小与目的片段大小相符， 表明PON2目的片段已插入至载体中。挑取PCR阳性克隆进行测序， 测序结果与PON2基因序列进行比对。比对结果显示获得的片段与PON2基因序列有99%的一致性， 其中的半胱氨酸突变成酪氨酸， 两者同属极性中性氨基酸， 对抗体的制备不会产生影响。

　　图1 PON2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）

　　Fig 1 Agarose gel electrophoresis analysis of PON2 by PCR

　　M: DNA marker; 1: PCR product of PON2.

　　2.1.3 PON2重组蛋白的表达与纯化 从阳性克隆中提取质粒， 转化入BL21(DE3)大肠杆菌中， 进行IPTG诱导表达， 结果见图2， 与BL21空菌对照相比， 目的克隆中有明显蛋白表达， 带GST标签的重组蛋白理论相对分子质量(Mr)应为46 000， 与图2中条带3显示的Mr相符。带His标签的重组蛋白理论Mr应为40 000， 与图2中条带4显示的Mr也相符， 因此我们成功获得了带GST标签及His标签的PON2重组表达载体。由于载体中GST标签来自寄生虫的序列， 从而使重组蛋白具有更高的免疫原性， 因此我们选择带GST标签的蛋白进行免疫， 带His标签的蛋白用于抗体检测。图中结果显示， 融合蛋白主要以包涵体的形式表达， 重组蛋白的纯度均在90%以上， 浓度为4 g/L以上， 适合用于免疫。通过Western blot检测， 应用抗GST 的抗体能够在相应位置检测到GSTPON2融合蛋白， 结果见图3。

　　图2 PON2重组蛋白SDSPAGE分析（略）

　　Fig 2 SDSPAGE analysis of PON2 fusion protein

　　1: Protein marker; 2: BL21 E.coli control; 3: GSTPON2 fusion protein (46 000); 4: HisPON2 fusion protein (40 000).

　　图3 GSTPON2融合蛋白的Western blot分析（略）

　　Fig 3 Western blot analysis of GSTPON2 fusion protein using antibody against GST

　　1: Null PGEX４T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 2: GSTPON2 fusion protein expressed in E.coli BL21.

　　2.2 兔抗人GSTPON2多克隆抗体的制备 将上述获得的GSTPON2重组蛋白经3次动物免疫后收集兔抗血清， 并在第1次加强免疫后进行Western blot检测特异性， 结果如图4， 用His标签的重组蛋白作为检测抗原， 与阴性对照比较（BL21菌体总蛋白）， 在相应位置有一特异性结合抗体的条带， Mr为40 000， 与HisPON2重组蛋白Mr一致。用免疫前正常兔血清与HisPON2重组蛋白杂交， 发现正常兔血清与HisPON2蛋白无反应， 这些结果说明此抗体与E.coli BL21空菌无反应而只与PON2目的片段有特异反应， 以上结果说明此次免疫是成功的。

　　图4 兔抗GSTPON2抗血清特异的Western blot分析（略）

　　Fig 4 Western blot analysis of specificity of rabbit antiserum against GSTPON2

　　1: BL21 E.coli control (primary antibody: normal rabbit serum); 2: HisPON2 fusion protein (primary antibody: normal rabbit serum); 3: BL21 E.coli control (primary antibody: rabbit antiserum against GSTPON2); 4: HisPON2 fusion protein (primary antibody: rabbit antiserum against GSTPON2).

　　2.3 抗血清的纯化 三次免疫后取兔血清进行辛酸硫酸铵法纯化多抗， 纯化抗体纯度经SDSPAGE电泳鉴定， 结果见图5。Mr约55 000处为抗体重链， 25 000处为抗体轻链， 由于纯化抗体为多抗， 所以在25 000处呈弥散状， 从图中可以看出， 纯化后抗体纯度在95%以上。

　　图5 抗GSTPON2多克隆抗体的纯化（略）

　　Fig 5 Purification of polyclonal antibody against GSTPON2

　　1: Protein marker; 2: GSTPON2 pAb.

　　2.4 多克隆抗体的鉴定

　　2.4.1 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的Western blot分析 文献报道， PON2在很多组织中广泛表达， 因此我们分别选择了人肝脏组织、 HeLa细胞系、 U937细胞系作为研究对象， 将组织和细胞裂解后获取裂解蛋白作为电泳样本， 用纯化的兔抗人GSTPON2的多克隆抗体进行Western blot分析（图6）。结果发现兔抗人GSTPON2重组蛋白的多抗均可特异识别肝脏组织、 HeLa细胞、 U937细胞中Mr约为39 000 的蛋白， 而PON2的天然蛋白Mr 39 398。说明制备的PON2多克隆抗体能结合天然PON2蛋白。

　　2.4.2 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光分析 由GeneCards数据库可知PON2在脑组织中有高表达， 用SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）进行多克隆抗体的间接免疫荧光分析， 结果见图7。PON2蛋白在细胞质膜上表达， 在间接免疫荧光试验中固定细胞时加用10 mL/L Triton X100进行通透化处理， 故胞质内亦明显的阳性着色。为进一步研究PON2的细胞定位奠定基础。

　　图6 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体对不同组织蛋白Western blot分析（略）

　　Fig 6 Western blot analysis of rabbit polyclonal antibody against PON2

　　1: Human liver tissue lysate; 2: U937 cell lysate; 3: HeLa cell lysate.

　　图7 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光分析（略）

　　Fig 7 Indirect immunofluorescence analysis of rabbit polyclonal antibody against human PON2 protein

　　A， B， C: pAb against PON2(30 mg/L); D， E， F: Normal rabbit serum (1∶1 000).

　　3 讨论
　　
　　Sergei等［6］报道PON蛋白作为Numb蛋白的伴侣参与细胞的不对称分裂过程中。细胞不对称分裂是由一个母细胞发育成二个不同的细胞， 在许多的发育进程中是非常重要的。细胞不对称分裂是通过祖细胞局限的决定子作用来实现的。在果蝇有丝分裂中， 神经命运决定子Prospero和Numb分别通过Miranda和PON定位于细胞基底区， 这些决定子与Inscutable和Bazooka的顶端定位一起控制纺锤体的方向， 以保证祖细胞分裂成顶端的成神经细胞和基底区的神经节母细胞。PON蛋白作为细胞不对称分裂中一个决定子发挥重要的作用。
　　
　　PON2作为PON基因中的其中一个成员， 以前的研究证明PON2多态性与家族性高胆固醇血症、 糖尿病等有关。但PON2作为细胞不对称分裂的决定子却鲜有研究。目前尚无抗PON2的商业化特异抗体， 这使得研究PON2功能的工作举步维艰。本实验以此为切入点， 制备了兔抗人PON2蛋白的多克隆抗体。本研究采用原核表达技术， 表达了GSTPON2和HisPON2融合蛋白， 并以GSTPON2为免疫原， 以HisPON2为检测原（提高检测的精确度）， 免疫动物成功制备了抗PON2抗血清。应用Western blot方法证明抗血清对PON2具有很好的识别特性， 应用间接免疫荧光染色检测细胞中表达的PON2， 其主要定位于细胞质中。研究PON2在细胞不对称分裂中的作用， 其重要问题是研究PON2与其他细胞不对称分裂决定子的在细胞分裂时的共定位问题， 以及PON2能否有PON蛋白作为Numb伴侣的作用。上述兔抗人PON2蛋白的多克隆抗体将为今后PON2分子的功能研究提供必要的工具。相应的单克隆抗体的制备实验已在进行中。

参考文献

　　［1］ Dragomir ID， John FT， Audrey S， et al. Human paraoxonases (PON1， PON2， and PON3) are lactonases with overlapping and distinct substrate specificities［J］. J Lipid Res， 2005， 46(6): 1239-1247.

　　［2］ Mira R， Tony H， Khetam H， et al. Decreased macrophage paraoxonase 2 expression in patients with hypercholesterolemia is the result of their increased cellular cholesterol［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2004， 24(1): 175-180.

　　［3］ Carey JN， Noam B， Victor G， et al. Paraoxonase2 deficiency aggravates atherosclerosis in mice despite lower apolipoproteinBcontaining lipoproteins［J］. J Bio Chem， 2006， 281(40): 29491-29500.

　　［4］ Robert AH， Philip WC， Stephen WS， et al. Paraoxonase2 Gene (PON2) G148 variant associated with elevated fasting plasma glucose in noninsulindependent diabetes mellitus［J］. J Clin Endocrinol Metab， 1997， 82(10): 3373-3377.

　　［5］ Carey JN， David JW， Aditya G， et al. Paraoxonase2 is a ubiquitously expressed protein with antioxidant properties and is capable of preventing cellmediated oxidative modification of low density lipoprotein［J］. J Bio Chem， 2001， 276(48): 44444-44449.

　　［6］ Sergei NP， William C. When timing is everything: role of cell cycle regulation in asymmetric pision［J］. Semin Cell Dev Biol， 2005， 16(3): 423-437.