抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

　　　　 作者：吴春风， 马忠森， 王秀丽， 杨俊玲， 杨洋， 张越， 图们乌力吉， 乔俊华

【摘要】 　　目的: 制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb）， 并鉴定其特异性。方法: 纯化的HisDcR3融合蛋白免疫小鼠， 应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化， 纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、 Ig亚型和效价。结果: 获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞， 均属IgG1亚型， 其腹水抗体效价为1×10-5～1×10-7， Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白， 其中1株（1B1）可与SW480细胞成分反应。结论: 成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株， 其分泌的抗体特异性强、 效价高， 为研究DcR3在组织中的表达、 分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。

【关键词】 DcR3 单克隆抗体 制备

　　[Abstract] AIM: To prepare monoclonal antibodies(mAbs) against human DcR3 and identify their characterization. METHODS: BALB/c mice were immunized with purified HisDcR3 protein， and mAbs against DcR3 which prepared by hybridoma technique were purified and identified by their specificity， subtype， titers via ELISA and Western blot. RESULTS: Five hybridoma cell lines secreting mAbs against human DcR3 were obtained， which were determined as IgG1 subtype and ascites titers of five mAbs against DcR3 reached 1×10-5-1×10-7. Five mAbs were proved to recognize HisDcR3 protein specifically， one of which (1B1) could recognize SW480 cell. CONCLUSION: mAbs against DcR3 with high titers and specificity have been prepared and purified successfully， which laid a foundation for the study of DcR3 expression， distribution in tissu and development of ELISA kit.

　　[Keywords]DcR3; monoclonal antibody; preparation

　　诱骗受体3(decoy receptor 3， DcR3， 又称TR6)为近年新发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员， 可竞争性结合肿瘤坏死因子(TNF)成员LIGHT、 FasL及TL1A[1， 2]， 但并不介导细胞凋亡， 在细胞的生长、 分化、 死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用， 与肿瘤、 自身免疫疾病、 移植排斥等密切相关。应用DcR3抗体研究DcR3在上述病变组织或细胞中的表达现已成为研究热点。目前， 国外已有商品化的抗人DcR3 mAb， 但价格昂贵， 国内尚无这方面的研究报道。我们运用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人DcR3 mAb， 并进行了鉴定， 为研究DcR3在组织中的表达、 分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 纯化的HisDcR3融合蛋白为本室自制[3]; RPMI1640购自Hyclone公司; PEG4000购自Merck公司; HAT、 HT购自Sigma公司; HRP标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗体购自Santa Cruze公司; 抗体亚类测定试剂盒购自Serotech公司; Protein A亲和层析胶购自Pierce公司; PVDF膜购自Amresco公司; ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。Sp2/0细胞株取自东北师范大学细胞遗传所; 高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞株由本室保存; BALB/c小鼠(6～8周龄， 雌性， 清洁级)购自吉林省生物制品所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物免疫 纯化的HisDcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠， 初次免疫取100 μL (约50 μg)抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化， 腹腔注射， 第14天取100 μL(约50 μg)加等量弗氏不完全佐剂加强免疫， 以后每隔2周等量抗原不加佐剂腹腔免疫2次， 测定小鼠血清抗体效价达1∶106以上时准备融合， 融合前3 d取效价最高的小鼠腹腔注射抗原100 μg。

　　1.2.2 杂交瘤细胞株的建立及mAb的制备 (1)细胞融合: 无菌条件下， 取对数生长的Sp2/0细胞， 1000 r/min离心8 min， 弃上清， 用RPMI1640不完全培养液混悬细胞后计数， 取所需的细胞数。制备免疫小鼠脾细胞悬液， 将Sp2/0细胞与脾细胞按1∶5的比例混合， 37℃水浴500 mL/L PEG4000作用下进行融合， 融合后1000 r/min离心8 min， 弃上清， 用含有饲养细胞的HAT选择培养液轻轻混悬， 接种在96孔细胞培养板中， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养。第10天换HT选择培养液， 第14天换含200 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养液。(2)筛选及克隆化: 2～3周后当杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时， 分别包被HisDcR3融合蛋白与His蛋白， 同时设立阴、 阳性及空白对照， 应用间接ELISA方法检测培养上清液。以P/N≥2.1为阳性， 选取与HisDcR3融合蛋白反应阳性而与His蛋白反应阴性孔的细胞通过有限稀释法连续克隆2～3次， 直至所有单个克隆细胞阳性孔率为100%时扩大培养， 进行细胞冻存和腹水制备。（3）腹水制备及纯化:每只BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡500 μL， 7 d后每只鼠腹腔接种杂交瘤细胞6×105个， 14 d左右采集腹水。SiO2吸附法对腹水进行预处理， 采用辛酸饱和硫酸铵沉淀法[4]、ProteinA亲和层析进行纯化， 紫外分光光度法测定纯化后mAb含量， 纯化后mAb过滤除菌加等量甘油， 分装-70℃冻存。

　　1.2.3 mAb的鉴定 （1）效价的测定: 将纯化前后的mAb倍比稀释， 以1∶200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照， 应用间接ELISA方法测定A492， 以P/N≥2.1为阳性。（2）免疫球蛋白类和亚类的鉴定: 按操作说明将杂交瘤上清1∶200稀释， 取150 μL稀释液加入含有亚类定性试剂的试管底部， 30 s后将试纸条插入管底， 5～10 min后观察结果， 判读轻链、 重链。(3)杂交瘤细胞染色体核型分析: 生长良好的杂交瘤细胞悬液10 mL加入秋水仙素， 使其终浓度为0.1 mg/L， 继续培养3 h， 1000 r/min离心10 min， 重蒸水室温低渗处理20 min， 离心弃上清， 细胞固定后Gimsa染色， 油镜下观察染色体计数。（4）相对亲和力鉴定: 参照文献[5]。采用非竞争ELISA方法确定单克隆抗体的亲和力。分别以不同浓度（1、 5、 10 g/L）的纯化的DcR3融合蛋白为固相， 加入倍比稀释的纯化mAb及HRP标记的羊抗小鼠IgG， 以OPD为底物测定A492值。按照公式Kaff=(n－1)/2(nAb’－Ab)计算各mAb亲和力大小。（5）Western blot鉴定抗体特异性: 将纯化的DcR3蛋白、 pET28a(+)空载体蛋白、 人结肠癌SW480细胞株培养上清及细胞裂解制成的细胞悬液经SDSPAGE电泳后转印至PVDF膜上， 以1∶5000稀释的小鼠腹水为一抗， 以1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗， 通过ECL显色系统进行Western blot检测。

　　2 结果

　　2.1 杂交瘤细胞株的建立 HAT选择培养3日可见融合的细胞克隆， 融合率为93.0%（269/288）， 阳性克隆率为85.0%（246/288）， 经有限稀释法对阳性克隆进行2～3次克隆， 共获得5株能稳定分泌特异性抗人DcR3的mAb杂交瘤细胞株， 分别命名为1A9、 1B1、 1F5、 1G4及2H6。

　　2.2 腹水mAb的纯化 腹水经proteinA层析柱纯化后， 进行SDSPAGE凝胶电泳扫描， 鉴定其纯度为95%。相对分子质量（Mr）为146000 (轻链为23000， 重链为50000， 图1）。紫外分光光度法测定纯化蛋白的浓度为15 g/L。

　　图1 纯化DcR3 mAb(1B1)的SDSPAGE分析（略）

　　Fig 1 SDSPAGE analysis of antibodies after ProteinA affinity chromatograph (1B1)

　　1: Purified mAb; 2: Prepurified mAb.　　　　　　　　

　　2.3 mAb的特性鉴定 mAb效价、 亚类、 染色体及亲和常数的鉴定， 结果见表1。

　　表1 mAb效价、 亚类、 染色体及亲和常数的鉴定（略）

　　Tab 1 Identification of mAb value， isotype， chromosome and affinity constant

　　2.4 Western blot分析 5株杂交瘤细胞株分泌的抗DcR3 mAb均能与转印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白在Mr约为33000处形成单一的阳性染色带， 并且与pET载体蛋白无交叉反应， 其中1B1 mAb可以识别高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞成分(图2)。

　　图2 mAb Western blot分析（略）

　　Fig 2 Western blot analysis of the 1B1 mAb

　　1: Purified DcR3 protein; 2: Induced pET28a(+) ; 3: SW480 lysate; 4: SW480 culture supernatant.

　　3 讨论
　　
　　DcR3 mRNA序列全长1114 bp， 含一个开放读码框， 编码300个氨基酸， N末端前29个氨基酸为信号肽序列， 蛋白Mr约35000。DcR3肽链含4个串联的富集半胱氨酸的重复序列， 此为TNFR超家族的共同标志， 但与其他大部分TNFR超家族成员不同的是DcR3缺乏跨膜结构， 故属于分泌性蛋白[2]。DcR3可竞争性地与TNF超家族成员FasL、 LIGHT、 TL1A结合， 抑制配体与死亡受体的结合， 从而阻断配体介导的细胞凋亡， 有助于肿瘤细胞、 活化的自身免疫细胞免受机体免疫系统的清除。研究表明DcR3在许多恶性肿瘤组织和细胞株（如人结肠癌SW480细胞株）以及自身免疫病的外周血单个核细胞（PBMC）过度表达[1， 6]。另有研究发现， DcR3表达水平与肿瘤分化类型和分期密切相关[7， 8]， 因此， 应用DcR3抗体通过免疫组化、 ELISA等方法观察DcR3在病变组织或体液中的表达情况对相关疾病的诊断、 预后及疗效观察具有重要作用。此外， 也可以利用DcR3 mAb中和DcR3蛋白， 解除其对肿瘤的抗凋亡和下调宿主免疫功能的作用， 达到辅助治疗肿瘤的的目的。
　　
　　我们利用本室自制并已经过纯化和鉴定的HisDcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠， 在传统的淋巴细胞杂交瘤技术基础上进行了以下优化: （1）改进免疫方案， 选择融合时机， 直至小鼠产生百万以上高抗体滴度时方进行融合， 此时分泌抗体的脾脏B淋巴细胞多， 大大增加了阳性克隆率; （2）根据融合后细胞生长情况适当增减HAT和HT用量， 以免毒性过大细胞死亡或剂量不足不能起到筛选作用; （3）对杂交瘤进行ELISA双筛选， 去除DcR3融合蛋白中His蛋白的干扰， 相对提高了免疫抗原的特异性， 保证所筛选到的杂交瘤细胞所分泌的mAb只针对DcR3抗原决定簇而非His决定簇。通过上述优化， 获得了高效价、 特异性强的抗人DcR3 mAb， 其中1B1杂交瘤细胞株分泌的mAb可识别高表达DcR3蛋白的人结肠癌SW480细胞株的细胞裂解悬液和培养上清。所建立的杂交瘤细胞株经数次冻存、 复苏， 体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌高效价mAb。总之， 抗人DcR3 mAb的成功研制， 为研究DcR3蛋白功能、 纯化DcR3蛋白、 临床上检测相关疾病血清DcR3含量及在组织细胞的表达分布奠定实验基础。

参考文献

　　[1] Yu KY， Kwon B， Ni J， et al. A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily (TR6) suppresses LIGHTmediated apoptosis[J]. J Biol Chem， 1999， 274(20): 13733-13736.

　　[2] Migone TS， Zhang J， Luo X， et al. TL1A is a TNFlike ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulator[J]. Immunity， 2002， 16(3): 479-492.

　　[3] 吴春风， 马忠森， 王秀丽， 等. 人DcR3融合蛋白的表达、 纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23（12）: 1160-1162.

　　[4] 赵永芳. 生物化学技术原理及应用[M]. 北京: 科学出版社， 2002: 429-430.

　　[5] 白慧玲， 赵粤萍， 刘广超， 等. 抗死亡受体5单克隆抗体的制备及特性鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22（4）: 514-520.

　　[6] Otsuki T， Tomokuni A， Sakaguchi H， et al. Overexpression of the decoy receptor 3 (DcR3) gene in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from silicosis patients[J]. Clin Exp Immunol， 2000， 119(2): 323-327.

　　[7] Takahama Y， Yamada Y， Emoto K， et al. The prognostic significance of overexpression of the decoy receptor for Fas ligand (DcR3) in patients with gastric carcinomas[J]. Gastric Cancer， 2002， 5(2): 61-68.

　　[8] Li H， Zhang L， Lou H， et al. Overexpression of decoy receptor 3 in precancerous lesions and adenocarcinoma of the esophagus[J]. Am J Clin Pathol， 2005， 124(2): 282-287.