牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

　　　　 作者：席俊， 张改平*， 何礼洋， 朱礼倩， 南楠， 张利娜， 邓瑞广， 李学伍

【摘要】 　　目的: 构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体， 并在E.coli BL21(DE3)中表达。方法: 提取健康成年牛的白细胞总RNA， 经RTPCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段， 并将其克隆到载体pGEMT Easy， 经限制性内切酶EcoRI和 NotI双酶切鉴定及序列测定后， 再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中， 构建重组质粒pET2R， 转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果: 获得682 bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET2R转化E.coli BL21(DE3)后， 经IPTG诱导， 表达出相对分子质量(Mr)约为30000的重组蛋白。SDSPAGE分析显示， 表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中， Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论: 成功地构建了原核表达载体pET2R， 并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。

【关键词】 牛Fcγ2R 胞外区基因 克隆 表达

　　Fc受体(FcR)是一类重要的免疫细胞表面分子， 不仅赋予免疫细胞杀伤病毒与细菌清除免疫复合物、 溶解癌变细胞的能力， 而且参与免疫反应的启动与调节[1]。IgFcR按所结合的Ig种类可将其分为FcγR、 FcεR、 FcαR、 FcμR和FcδR 5大类， 其中FcγR是Fc受体中最重要的1种， 人和小鼠都存在有FcγRI、 FcγRⅡ和FcγRⅢ 3个亚类又分别被称为CD64、 CD32和CD16[2]。人们对它们的结构、 功能和生物学特性已有较深入的了解， 已获得FcγRII和FcγRIII的晶体结构[3， 4]， 并对FcγR与IgG的作用位点进行了分析鉴定。牛FcγR的研究比较滞后， 张改平研究小组率先开展了牛FcγR的克隆和鉴定工作， 发现牛FcγR有4种类型: boFcγRI、 boFcγRII、 boFcγRIII和boFcγ2R， 其中对于boFcγ2R的研究较为全面。1995年Zhang等首次发现boFcγ2R 基因， 功能实验表明该受体只特异性亲和牛IgG2， 但其与人和小鼠FcγR相距甚远， 而与人类IgA Fc受体FcαRI(CD89)具有较高同源性， 可并不亲和牛和人类IgA， 所以代表了一类新型哺乳动物的IgG Fc受体， 于是根据其配体特异性命名为boFcγ2R， 即牛IgG2 Fc受体[5]。这一研究结果揭示了反刍动物IgG2超级免疫作用的物质基础， 也在一定程度上为解释反刍家畜初乳中不含IgA提供了理论依据， 同时引起了一系列同源分子的发现和新的细胞激活途径的发现。2001年Morton等[6]证明boFcγ2R的EC1区是亲和IgG2Fc的特异结构功能区， 2006年Zhang等[7]又将boFcγ2R的线性配体结合表位精确定位于EC1区FG loop的4肽区域。这些发现对于探索反刍动物免疫调节的分子机制， 及开发新药和新药靶的研究提供新的思路。为了进一步研究这一新型受体和IgG的相互作用机制及其介导的免疫反应， 我们用RTPCR技术扩增了boFcγ2R的胞外环区并在大肠杆菌中进行了表达。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pGEMT Easy Vector SystemⅠ、 EZ spin column total RNA isolation kit、 限制酶EcoR I和Not I、 T4 DNA连接酶购自promega公司; pET28a Vector、 E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)均购自宝生物工程（大连）有限公司; AEC(3Amino9ethylcarbazole)显色试剂盒为华美生物公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 参照张改平发表的牛Fcγ2R的基因（Z37506）核苷酸序列利用引物设计软件Primer 5.0设计了一对引物: 上游引物B11: 5′CCGGGAATTCAGTGTGGGCCTAAGGA3′， 下游引物B12: 5′TTTAGCGGCCGCCCGGATGAGATTCTGC3′， 由大连宝生物生物工程公司合成。为便于基因的克隆及构建表达载体等后续工作， 在引物中引入EcoR I、 Not I酶切位点。

　　1.2.2 总RNA的提取和RTPCR 从新鲜抗凝牛血中分离牛白细胞， 用EZ spin column total RNA isolation kit提取总RNA， 以B11、 B12为引物， 按照RTPCR试剂盒操作手册对boFcγ2R基因进行RTPCR扩增， 反应体系如下: RNaseFree Water 23 μL， AMV/Tf1 5× Reaction Buffer 10 μL， dNTP Mix (10 mmoldNTP) 1 μL， Dowmstream primer 1 μL（50 pmol）， Upstream primer 1 μL（50 pmol）， 25 mmol/L MgSO4 2 μL， AMV Reverse Transcriptase 1 μL， Tf1 DNA Polymerase 1 μL， RNA sample 10 μL， Final volume 50 μL。第1链cDNA合成参数为48℃反转录45 min。第2链合成时先在94℃预变性2 min， 同时灭活AMV反转录酶; 然后进入以下40个循环: 以94℃变性0.5 min， 60℃退火1 min， 68℃延伸2 min; 循环完毕后68℃继续延伸10 min。将RTPCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 并回收目的片段。

　　1.2.3 目的基因的克隆与测序 将回收、 纯化的目的基因片段与pGEMT Easy载体于16℃连接过夜， 次日转化到JM109感受态细胞中， 提取质粒酶切鉴定和序列测定。

　　1.2.4 重组表达载体的构建和鉴定 将克隆到T载体上的阳性质粒经EcoR I和Not I双酶切， 获得的目的片段插入表达载体pET28a相应酶切位点， 重组pET28a转化表达菌BL21（DE3）， 挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定， 并命名为pET2R。

　　1.2.5 重组蛋白的表达 将阳性重组质粒转化BL21(DE3)表达宿主菌中， 挑取单菌落， 接种到5 mL LB（含50 mg/L卡那霉素）培养液中37℃振荡过夜培养， 次日以1%的接种量转入5 mL的LB培养液（含50 mg/L卡那霉素）中， 培养至A600=0.6左右时， 加IPTG(终浓度为1 mmol/L)进行诱导， 再于37℃培养3～6 h， 4000 r/min离心20 min收集菌体， 用含100 mg/L溶菌酶的PBS重悬菌体， 经超声波裂解后， 4℃ 12000 r/min离心15 min， 分离细胞裂解液上清和沉淀， 以SDSPAGE鉴定表达结果。

　　1.2.6 Western blot检测 IPTG诱导的pET2R全菌和未诱导全菌进行120 g/L SDSPAGE后， 将电泳分离的蛋白带电转到PVDF膜， 50 mL/L鸡血清封闭过夜， 将膜放入PBST中洗6次， 每次3 min， 加1∶200倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的牛IgG2 37℃孵育2 h， PBST洗膜6次， 每次3 min， AEC显色检测目的蛋白。

　　1.2.7 Dot blot分析 在硝酸纤维素膜(Millipore)上点印包涵体蛋白(分别以4、 2、 1、 0.5、 0.25 μg量点膜)， 以BSA作阴性对照; 自然干燥后， 将印迹膜放入含1 g/L明胶的洗涤液中37℃封闭1 h; 加入以1 g/L明胶稀释的10 mg/L HRP标记牛IgG2(HRPIgG2)溶液37℃孵育1 h， 以PBST充分洗涤; 用AEC (3Amino9ethylcarbazole)显色试剂盒参照操作说明进行显色。结果判定时， 以包被包涵体蛋白点呈现棕红色颜色变化， 阴性对照点不出现颜色变化进行判定。

　　2 结果

　　2.1 总RNA的提取和RTPCR结果 总RNA提取以后做RTPCR， RTPCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 显示出一条682 bp左右的条带（图1）， 与预期大小相符。

　　2.2 牛Fcγ2R胞外区cDNA克隆与序列测定 将目的片段和T载体的连接产物转化JM109， 37℃培养过夜后挑取单个菌落， 小量提取质粒后用EcoR I、 Not I双酶切消化， 经琼脂糖凝胶电泳检测， 可见大小为682 bp左右的片段（图2）， 与预期结果相符， 表明特异片段插入了T载体。测序后， 和已报道的牛Fcγ2RcDNA序列完全相符。

　　图1 RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳（略）

　　M: DNA marker; 1: PCR产物.

　　图2 克隆载体的酶切鉴定（略）

　　M: DNA marker; 1: T2R被EcoR I 和 Not I双酶切产物.

　　2.3 重组表达载体的鉴定 重组质粒经EcoR I、 Not I双酶切鉴定， 在682 bp左右有一特异条带和预期大小相符（图3）。

　　图3 重组质粒pET2R的酶切鉴定（略）

　　1:重组质粒pET2R被EcoRI和NotI双酶切;M:DNA marker（1000bp）.

　　2.4 牛Fcγ2R胞外区的诱导表达 用pET2R表达质粒转化BL21(DE3)宿主菌， 以1 mmol/L IPTG诱导表达。诱导菌SDSPAGE电泳结果显示， 诱导3 h后可见Mr 30000的重组蛋白， 且表达量基本稳定， 而未诱导的宿主菌以及诱导的pET28a空载体对照菌均未见明显的表达蛋白， 和预期相符（图4A）， 裂解诱导表达菌体， 对表达蛋白进一步分析， 表明大部分表达蛋白存在于裂解菌体的不溶性沉淀中， 而在可溶性裂解菌体溶液中的含量很少， 表明boFcγ2R表达蛋白在菌体内主要以不溶性包涵体形式存在。

　　2.5 Western blot检测 如图4B所示， 重组蛋白在PVDF膜上显示Mr 30000的蛋白条带， 而重组质粒诱导前细菌裂解液则没有。

　　图4 boFcγ2R胞外区的诱导表达及鉴定（略）

　　A: SDSPAGE; B: Western blot. M: 低Mr marker蛋白质对照; A1: BL21诱导后产物; A2: pET2R在BL21中诱导后产物; A3: pET2R在BL21中未诱导的产物; B2: pET2R在BL21中诱导后产物; B3: pET2R在BL21中未诱导的产物.

　　2.6 Dot blot检测 以Dot blot检测包涵体蛋白与HRPIgG2的结合， 结果显示HRPIgG2与boFcγ2R包涵体蛋白结合特异性良好（图5）。

　　图5 boFcγ2R包涵体与牛IgG2的结合（略）

　　A: 4 μg boFcγ2R包涵体蛋白; B: 2 μg boFcγ2R包涵体蛋白; C: 1 μg boFcγ2R包涵体蛋白; D: 0.5 μg boFcγ2R包涵体蛋白; E: 0.25 μg boFcγ2R包涵体蛋白; F: 4 μg BSA.

　　3 讨论
　　
　　boFcγ2R主要存在于牛白细胞中， 提取的白细胞质量是本试验的关键。在最初的多次实验中发现， 淋巴细胞分离液不适用于提取牛的白细胞， 后来改用双蒸水裂解法才成功提取出较高质量的白细胞， 为后来高质量总RNA的提取及RTPCR的顺利进行奠定了基础。boFcγ2R的cDNA由1582个核苷酸组成， 含有单个ORF， 计792个核苷酸（264个氨基酸）， 前19个氨基酸为具有明显疏水特征的信号肽， 成熟蛋白起始于第20位的谷氨酸（Gln）。胞外区由211个氨基酸组成， 4个半胱氨酸均匀分布， 构成2个Ig样闭环(EC1、 EC2)， EC1是亲和IgG2 Fc的特异结构功能区[8]。3个N糖基化位点分布于86126和135位。胞外区之后是19个氨基酸的跨膜区和15个氨基酸的胞质区尾巴。本试验旨在获得boFcγ2R胞外区即EC区的序列， 所以在设计引物时将上下游引物分别放在EC区的两侧即在ORF的第14A233A之间共220个氨基酸。
　　
　　本试验中将编码220个氨基酸的boFcγ2R胞外区基因片段克隆于原核表达载体pET28a， 经过IPTG的诱导， 诱导菌体裂解物经SDSPAGE分析有目的蛋白表达。用酶标的牛IgG2进行Western blot和Dot blot检测， 该蛋白在变性条件下能和牛IgG2结合， 也是对Zhang等[7]证明boFcγ2R有线性配体结合表位的肯定。最重要的是boFcγ2R胞外区在大肠杆菌中的成功表达为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。

参考文献

　　[1] CohenSolal JF， Cassard L， Fridman WH， et al. Fcγ receptors[J]. Immunol Lett， 2004， 92(3): 199-205.

　　[2] Jeffrey V， Ravetch， Silvia Bolland. IgG Fc Receptors[J]. Annu Rev Immunol， 2001， 19: 275-290.

　　[3] Sondermann P， Huber R， Oosthuizen V， et al. The 3.2A crystal structure of the human IgG1 Fc fragmentFc gammaRIII complex[J]. Nature， 2000， 406(6793): 267-273.

　　[4] Zhang Y， Boesen CC， Radaev S， et al. Crystal structure of the extracellular domain of a human Fc gamma RIII[J]. Immunity， 2000， 13(3): 387-395.

　　[5] Zhang G， Young JR， Tregaskes CR， et al. Identification of a novel class of mammalian Fcγ receptor[J]. J Immunol， 1995， 155(3): 1534-1541.

　　[6] Morton HC， Howard CJ， Storset AK， et al. Identification of residues within the extracellular domain 1 of bovine Fcγ2R essential for binding bovine IgG2[J]. J Biol Chem， 2001， 276(51): 47794-47800.

　　[7] Zhang G， Guo JQ， Zhou JY. Identification of the linear epitope for Fcbinding on the bovine IgG2Fc receptor (boFcγ2R) using synthetic peptides[J]. FEBS Letters， 2006， 580(2006): 1383-1390.