血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定

　　　　 作者：石琦， 单冰， 高晨， 姜慧英， 张宝云， 韩俊， 董小平

【摘要】 　　目的: 制备血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(mAb)， 并对其特性进行鉴定。方法: 以重组HisTrxVEGF1165蛋白为抗原， 通过免疫、 融合、 克隆和筛选等方法制备VEGF mAb， 制备小鼠腹水并测定其效价、 染色体数目及免疫球蛋白亚类， 用Western blot方法分析其特异性。结果: 成功筛选出能稳定分泌的VEGF mAb杂交瘤细胞株4E4H5， 制备腹水的ELISA效价为1∶106; 染色体数目为105条; 抗体分型为IgG1亚型， κ轻链; Western blot证实所获得的mAb可与VEGF全长蛋白发生特异性反应， 但是与融合蛋白的标签蛋白HisTrx不发生反应。结论: 制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高滴度和高特异性的VEGF mAb， 为建立能够用于肝癌诊断的血清VEGF检测技术提供了参考。

【关键词】 血管内皮生长因子 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验

　　血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)最早是由Leunq等[1]于1989年在牛垂体星状细胞培养液中提纯的蛋白质。它是胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原， 也是一种血管形成和血管通透性诱导因子， 在血管发生和形成过程中起着重要的调控作用[2]。肿瘤的生长和转移是一个多步骤的复杂过程， 其中肿瘤血管的生成起重要的作用。迄今为止， VEGF被认为是肿瘤组织中促血管生成的最主要的血管生长因子[3]。近年来， 人们已经在人和动物的多种肿瘤组织， 包括肝癌细胞中都发现VEGF的过度表达， 且表达水平随着癌变程度增加而逐渐升高。另外， VEGF的表达与血管生成及细胞增生程度相关， 且其过度表达影响肿瘤的侵袭和转移[4]。基于这些理论基础， 我们在原核系统中表达了含165个氨基酸的VEGF全长蛋白， 以此为免疫原制备了小鼠抗人VEGF全长蛋白的单克隆抗体(mAb)， 并对其特性进行了鉴定， 获得了能稳定分泌抗VEGF mAb的杂交瘤细胞株。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 HisTrxVEGF1165蛋白、 pET32a载体、 Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞株由本室制备保存;　　弗氏完全、 不完全佐剂购自Sigma公司; 次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷（HAT）及次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷（HT）购自Hyclone公司; PEG1500购自Roche公司; antiVEGF mAb购自R&&D公司; 辣根过氧化物酶（HRP）山羊抗小鼠IgG购自PIERCE公司; 小鼠mAb分型检测试剂盒购自Roche公司; ECL检测试剂盒购自PerkinElmer公司; ELISA显色液购自北京万泰生物公司; BALB/c纯系小鼠（6～8周龄， 雌性， 质量17～20 g）， 购自北京生物制品研究所动物部。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫动物 将100 μg纯化的HisTrxVEGF1165蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合， 充分乳化， 经腹腔注射免疫BALB/c小鼠。以后每隔2周进行1次免疫， 采用100 μg HisTrxVEGF1165蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合、 乳化后经腹腔注射免疫， 共免疫4次。

　　1.2.2 杂交瘤细胞株的制备 提前制备正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞， 进行细胞融合[5]: 末次免疫后3 d取脾， 同时眼部取血， 离心分离血清备用。将小鼠脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞按10∶1比例混合于50 mL尖底离心管中， 置于37℃水浴中， 于1 min内缓慢滴入1 mL预热的PEG1500， 静置5 min， 用无血清RPMI1640液终止作用， 离心收集细胞。将细胞首先悬于含HAT的选择培养基中， 接种于96孔培养板中， 100 μL/孔， 接种密度为每孔1个或2个细胞， 10 d后改用HT培养液， 3周后改用普通RPMI1640培养液（含200 mL/L胎牛血清）培养。

　　1.2.3 克隆细胞株的筛选培养 应用间接ELISA法[6]: 融合后8～12 d， 待融合细胞生长到培养孔的1/3～1/2时， 取上清用间接ELISA法进行筛选。包被用抗原为可溶性重组HisTrxVEGF1165蛋白50 ng/孔， 融合细胞上清加100 μL/孔， 以Sp2/0细胞培养上清液作为阴性对照， 阳性对照为商品化的VEGF mAb， 二抗为1∶4000 HRP山羊抗小鼠IgG， 100 μL/孔， 经TMB底物显色后， 酶标仪测定A450值。凡A450值大于阴性对照（Sp2/0细胞培养上清） 2倍以上者， 初步判定为阳性克隆。选择阳性孔用有限稀释法进行3～4次亚克隆， 建立稳定分泌VEGF mAb的杂交瘤细胞株， 至所有杂交瘤细胞上清液均呈阳性为建株标准， 扩大培养后液氮冻存。

　　1.2.4 杂交瘤细胞染色体的检测 将杂交瘤细胞培养至对数生长期加入终浓度为0.3 mg/L的秋水仙素， 于37℃继续培养4～6 h， 收集细胞， 加入预热的0.075 mol/L KCl， 37℃保温30 min。用甲醇与冰醋酸混合液（二者比例为3∶1）固定3次， 制片， Giemsa染色， 进行观察。每份标本计数100个完整的中期细胞， 计算染色体的平均数量。

　　1.2.5 腹水制备及抗体纯化 小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5 mL/只， 7～14 d后， 经腹腔接种杂交瘤细胞（106～107个/0.5 mL）。待小鼠出现腹部肿胀、 消瘦、 呼吸急促、 活动减少等体征时， 开始收集腹水， 2000 r/min离心10 min， 收集上清分装保存于-70℃备用。

　　1.2.6 Ig亚类（型）的鉴定 取杂交瘤细胞培养上清液， 按Sigma公司小鼠mAb亚型检测试剂盒操作说明进行。

　　1.2.7 Western blot检测mAb的特异性 将载体pET32a转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达纯化的HisTrx蛋白及纯化的HisTrxVEGF1165蛋白经SDSPAGE电泳后， 电转至硝酸纤维素膜， 一抗为制备的VEGF mAb（1∶1000）稀释， 二抗为HRP羊抗鼠多抗（1∶5000）稀释， ECL显色。

　　2 结果

　　2.1 VEGF mAb杂交瘤细胞系的建立 使用PEG1500对免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合， 第5天开始出现融合细胞。经ELISA方法检测， 凡A450值大于阴性对照（Sp2/0细胞培养上清） 2倍以上者， 初步判定为阳性克隆。计数杂交瘤细胞阳性孔数， 计算其与成功生长杂交瘤细胞孔数之比， 计算得杂交瘤细胞阳性率为20.5%。经VEGF特异性间接ELISA筛选， 获得8个阳性的融合细胞孔。对8个阳性孔再进行一次性克隆， ELISA筛选有15个单克隆细胞株抗体检测为阳性。对其规律传代培养至第5代， ELISA检测每代细胞分泌抗体情况， 4E4H5细胞株能够稳定分泌抗VEGF抗体。将此细胞株体外继续培养1个月后液氮冻存， 复苏后仍能稳定分泌抗VEGF抗体。

　　2.2 mAb滴度的测定 用间接ELISA法测定抗体滴度， 设立4个平行孔， 计算其平均值得到最终滴度值。以此稳定分泌VEGF mAb的杂交瘤细胞株4E4H5腹水效价为1∶106。

　　2.3 杂交瘤细胞株染色体数目及抗体亚类和型的鉴定 应用秋水仙素法检测得染色体数目为105条， 基本符合脾细胞和Sp2/0细胞染色体数目之和。杂交瘤细胞株所分泌的抗体为IgG1亚型， κ轻链。

　　2.4 VEGF mAb特异性鉴定 应用Western blot方法对获得的mAb进行检测， 此株mAb能与纯化的HisTrxVEGF1165蛋白发生特异性反应， 在Mr 38000的位置可见明显条带（图1）， 但是与融合蛋白的标签蛋白HisTrx不发生反应。

　　图1 Western blot鉴定mAb的特异性（略）

　　1: HisTrx; 2: HisTrxVEGF1165; M: 蛋白marker.

　　3 讨论
　　
　　近年来大量研究表明， VEGF作为血管新生重要调节因子， 在绝大多数恶性肿瘤中（包括血液系统恶性肿瘤）均呈现高表达。一些研究也证实， 肝癌组织中VEGF的表达水平与肿瘤血管发生和病情进展有着显著的关联性[7]。VEGF是肝素结合型二聚体糖蛋白， 有5种剪接异构体， 分别包括121、 145、 165、 189、 206个氨基酸， 但是VEGF165是体内最丰富的亚型， 具有最有力的生物学活性， 因此， 我们在选择免疫原时， 选择了在组织中含量最高， 分布最广的含165个氨基酸的VEGF蛋白[8]。
　　
　　本研究中， 以纯化的重组VEGF蛋白为抗原， 腹腔注射多次免疫获得能够分泌抗VEGF mAb的小鼠脾细胞。在PEG1500的诱导下， 小鼠脾细胞能较好地与Sp2/0骨髓瘤细胞在体外融合， 建立的能稳定分泌抗VEGF mAb的杂交瘤细胞株在体外连续传代5次（连续培养2个月）， 其分泌抗体的能力没有明显变化。经冻存复苏后， 杂交瘤细胞长势良好， 仍能稳定地分泌mAb， 表明本研究建立的杂交瘤细胞株具有较好的稳定性。我们将此株mAb与免疫原蛋白及其标签蛋白进行Western blot反应， 其只与免疫原发生特异性反应， 表明此株mAb能准确识别VEGF抗原， 同时具有良好的特异性。另外， 我们在Sp2/0骨髓瘤细胞培养方面也做了一些改进和尝试， 将1×109/L密度的细胞0.5 mL注射至小鼠腋下， 使得肿瘤细胞在局部生长10～14 d， 当肿瘤大小直径约1 cm时， 处死小鼠， 研磨组织获得Sp2/0细胞培养2～3 d， 观察细胞状态良好时， 即可进行融合实验。此方法获得的Sp2/0细胞状态好， 而且细胞培养时间易于掌握， 节省很多人力和时间。VEGF mAb的制备为进一步深入研究VEGF的生物学功能， 建立能够用于肝癌诊断的血清VEGF检测技术提供了参考。

参考文献

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　　[2] Wizigmann VS， Plate KH. Pathology， genetics and cell biology of hemangioblastomas[J]. Histol Histopathol， 1996， 11(4): 1049-1061.

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　　[5] 张 君， 张 娟， 唐 霓， 等. 抗O139群霍乱弧菌单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22（3）: 374-376.

　　[6] 高 晨， 李 锋， 周 伟， 等. 血清MMP9蛋白ELISA检测方法的建立及在肝癌患者血清检测中的初步应用[J]. 中华检验医学杂志， 2007， 30（3）: 288-291.

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　　[8] Ylaherttuala S， Martin JF. Cardiovascular gene theraphy[J]. Lancet， 2000， 355(9199): 213-222.