赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

　　　　 作者：黄毕， 鲍朗*， 钟琪， 商正玲， 张会东， 张英

【摘要】 　　目的: 构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS7细胞中表达， 为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法: 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因， 双酶切构建重组质粒pcDNA3.1LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS7细胞， 通过RTPCR、 Western blot检测目的基因的表达。结果: 成功构建了LipL32基因的真核表达载体， 并在COS7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论: 赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达， 为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。

【关键词】 钩端螺旋体 外膜蛋白LipL32 真核表达

　　由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（简称钩体病）是一种世界范围内广泛分布的人兽共患自然疫源性疾病， 严重危害人类健康和农牧业生产[1]。我国是钩端螺旋体病高发国家， 遍布三十多个省、 市、 自治区。近几十年来已有数次大规模的流行， 对我国农牧业生产和农民身体健康造成极大危害。尽管近年来钩端螺旋体病总体发病率和死亡率有所降低， 但是一旦自然条件发生变化（如洪灾、 地震等）， 极有可能造成局部或全面爆发流行。加上近年来流行菌群的更迭， 缺乏敏感的早期诊断方法和广谱高效的疫苗， 钩端螺旋体病仍然严重威胁着我国人民尤其是农民的健康。钩端螺旋体菌型复杂， 仅致病性钩端螺旋体就有23个血清群、 200个以上的血清型， 我国至少可以确定有26个国际新血清型， 是世界上血清群型最多的国家。而目前广泛使用的钩端螺旋体灭活疫苗诱导的免疫保护不完全， 保护时间短， 菌型间交叉免疫保护性弱。因此， 开发广谱、 高效、 持久的新型疫苗势在必行。本研究室率先在国内外进行钩端螺旋体DNA疫苗的研究， 曾将钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因制备DNA疫苗， 免疫动物后发现该DNA疫苗具有明显的免疫保护作用[2]。LipL32是钩端螺旋体含量最多的外膜蛋白， 在钩端螺旋体的致病、 免疫保护过程中可能起着十分重要的作用[3]。本研究即以赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因为目的基因， 构建其真核表达载体并转染哺乳动物细胞， 旨在为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 钩端螺旋体017株， 本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒pcDNA3.1、 宿主菌E.coli DH5α、 COS7细胞本研究室保存。PCR试剂盒购于TaKaRa公司; 限制性核酸内切酶、 DNA连接试剂盒及反转录试剂盒为晶美公司产品; 脂质体转染试剂、 TRIzol购自Invitrogen公司; DNA提取试剂盒、 胶回收试剂盒、 细胞可溶性蛋白提取试剂盒、 6×His单克隆抗体（mAb）、 DAB显色液购自Tiangen公司; βactin多克隆抗体购于精博生物技术公司; 二抗（羊抗鼠IgGHRP及羊抗兔IgGHRP）为北京中衫公司产品; 其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 钩端螺旋体017株基因组的提取 参照Terpstra等[4]方法并略加修改。

　　1.2.2 LipL32基因PCR扩增 根据GenBank数据库中LipL32基因的序列设计引物， 上游和下游分别引入Kpn I和EcoR I的酶切序列。P1: 5′CGGGTACCGAAGGAGAGTCTATGAAAAAAC3′， P2: 5′GCTGCCGCCACCGCCGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCCGGAATTCCTTAGTCGCGTCAGAAGC3′（划线部分分别是KpnI和EcoRI酶切位点）（Invitrogen公司合成）。PCR反应体系: 按TaKaRa公司PrimerSTARTMHS DNA Polymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板， P1、 P2为引物， 98℃变性10 s， 55℃退火5 s， 72℃ 90 s， 30个循化。取PCR产物进行80 g/L琼脂糖凝胶电泳， 胶回收试剂盒回收目的基因。

　　1.2.3 重组载体的构建和鉴定 将载体pcDNA3.1、 LipL32基因分别用Kpn I和EcoR I限制性核酸内切酶双酶切后， 胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接4 h。转化宿主菌E.coli DH5α， 挑取阳性克隆摇菌、 提取质粒进行双酶切、 PCR鉴定， 同时将重组载体送Invitrogen公司测序。空载体pcDNA3.1转化E.coli DH5α方法同上。

　　1.2.4 转染质粒的提取 分别挑取重组成功的单克隆菌落和空载体菌落于10 mL LB培养基中37℃振荡培养过夜（Amp 50 mg/L）， 次日提取质粒， 电泳鉴定及紫外分光光度法测定质粒的纯度和浓度， -20℃备用。

　　1.2.5 COS7细胞的复苏和培养 从液氮罐中取出细胞， 迅速解冻， 加到含100 mL/L小牛血清RPMI1640培养液中。37℃、 50 mL/L CO2孵箱培养， 待细胞生长达80%汇合时， 以2.5 g/L胰酶消化传代。

　　1.2.6 COS7细胞的脂质体转染 将对数期生长的COS7细胞按105个/孔接种至6孔板中， 培养24～36 h至细胞生长达80%汇合时转染。按LipofectamineTM2000说明书进行。分别用RPMI1640培养液稀释重组质粒pcDNA3.1LipL32、 空载体pcDNA3.1和LipofectamineTM2000脂质体。将脂质体和DNA混合后室温静置15 min。转染细胞用无血清的RPMI1640培养液洗涤2次， 然后逐滴加入所制备的脂质体DNA混合物。重组质粒转染组和空载体转染组分别转染6孔。留1孔仅加RPMI1640培养基作空白对照。37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养6 h后弃转染液， 加入2 mL含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液继续培养48 h收获瞬时转染细胞。稳定转染细胞株的筛选参照文献[5]。将转染细胞转移至培养瓶中加入G418至浓度为800 mg/L，同时设对照（未转染过的COS7细胞）一瓶， 培养至对照组细胞大部分死亡， 将G418浓度降至400 mg/L， 继续培养至细胞80%汇合， 收获稳定转染细胞。

　　1.2.7 RTPCR检测LipL32基因在COS7细胞中的表达 RNA的提取按照TRIzol法进行， 提取的RNA经电泳检测后， 按反转录试剂盒说明书进行反转录。PCR体系和反应条件同1.2.2， 仅将模板换成cDNA。为排除DNA污染， 以重组质粒转染细胞所提RNA为模板， 体系和反应条件同上做PCR扩增。同时作内参GAPDH的PCR扩增。

　　1.2.8 Western blot鉴定目的基因在COS7细胞中的表达 收获稳定转染的COS7细胞， 按细胞可溶性蛋白提取说明书操作收获细胞可溶性蛋白。将收获蛋白SDSPAGE电泳后， 转至PVDF膜， 以加6×His mAb（1∶200）为一抗; 以加羊抗鼠IgGHRP(1∶5000)为二抗， DAB显色， 同时做βactin的对照。空载体pcDNA3.1转染组Western blot检测方法同上。

　　2 结果

　　2.1 赖型钩端螺旋体017株LipL32基因的PCR扩增 扩增出一特异性条带， 约810 bp（图1）。

　　图1 钩端螺旋体017株LipL32基因的PCR扩增（略）

　　Fig 1 PCR product of LipL32 amplified from Leptospira strain 017 genomic DNA

　　M: DNA marker; 1: Product for LipL32.

　　2.2 LipL32真核重组质粒的构建和鉴定 挑取阳性克隆摇菌提取质粒经80 g/L琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后， 用Kpn I 和EcoR I双酶切鉴定并以提取质粒为模板， P1、 P2为引物进行PCR扩增， 空载体pcDNA3.1作对照。双酶切结果示该重组质粒含有一810 bp左右的片段， PCR结果示该重组质粒能扩增出目的片段， 而空载体pcDNA3.1未能扩增出， 测序结果和GenBank中LipL32基因序列比对， 100%匹配， 表明重组质粒构建成功(图2)。

　　2.3 转染质粒的提取 琼脂糖电泳显示， 大部分DNA呈超螺旋构型， DNA A260/280=1.8～1.9， 适合转染。

　　2.4 脂质体DNACOS7细胞的瞬时转染和稳定株的筛选 由于脂质体对细胞有毒性， 转染后细胞有部分形态皱缩或死亡， 培养液中可见结构破坏后的碎点。加入高浓度的G418后， 转染和未转染的细胞均出现大量皱缩变性细胞， 至第5天未转染组细胞几乎全部死亡， 质粒转染组尚有活细胞存在， 降低G418浓度继续培养1周， 得到稳定转染的细胞株。

　　图2 LipL32基因真核重组质粒的构建及鉴定（略）

　　Fig 2 Construction and identification of the eukaryotic recombinant vector

　　M: DNA marker; 1: Plasmid pcDNA3.1; 2: Recombinant plasmid(pcDNA3.1 LipL32); 3: Plasmid pcDNA3.1 digested with EcoR I; 4: Recombinant plasmid(pcDNA3.1 LipL32) digested with EcoR I; 5: Recombinant plasmid digested with Kpn I and EcoR I ; 6: PCR product amplified from recombinant vector with primer P1 and P2; 7: PCR product amplified from plasmid pcDNA3.1.

　　2.5 质粒转染的COS7细胞RTPCR检测 分别提取重组质粒转染组、 空载体转染组和空白对照组细胞RNA， 进行RTPCR检测。结果， 重组质粒转染组能扩增出目的基因， 而空载体转染组和空白对照组均未能扩增出目的基因。同时， 以提取重组质粒转染组细胞的RNA为模板进行PCR扩增也未能扩增出目的基因， 表明目的基因能在COS7细胞中表达（图3）。

　　图3 RTPCR检测LipL32基因在COS7细胞中的表达（略）

　　Fig 3 Expression of LipL32 gene in COS7 cell by RTPCR analysis

　　M: DNA marker; 1: RTPCR with RNA from COS7 cell with recombinant plasmid; 2: RTPCR with RNA from COS7 cell with plasmid pcDNA3.1; 3: RTPCR with RNA from COS7 cell without transfection; 4: PCR with RNA from COS7 cell with recombinant plasmid.

　　2.6 LipL32基因表达的Western blot鉴定 重组质粒转染组Western blot分析显示在Mr 30000左右出现一特异性的条带， 和预期目的蛋白的Mr吻合， 而空载体转染组未出现阳性条带， 表明重组质粒转染组细胞有目的蛋白的表达(图4)。

　　图4 重组质粒转染COS7细胞后目的蛋白表达的Western blot鉴定（略）

　　Fig 4 Western blot analysis of the expressed target protein after transfection

　　M: Protein marker; 1: Recombinant plasmid transfection group(with 6×His monoclonal antibody as first antibody); 2: Plasmid pcDNA3.1 transfection group(with 6×His monoclonal antibody as first antibody); 3: Recombinant plasmid transfection group(with βactin multiclonal antibody as first antibody); 4: pcDNA3.1 transfection group(with βactin multiclonal antibody as first antibody).

　　3 讨论
　　
　　本研究室曾将钩端螺旋体多个基因制备成钩端螺旋体DNA疫苗， 免疫动物后攻击试验证明这些DNA疫苗有一定的免疫保护效应， 说明应用DNA疫苗预防钩端螺旋体病是可行的[2， 6]。由于钩端螺旋体血清型众多， 要研制具有广谱的DNA疫苗， 必须选择在众多血清型中相对保守以及具有免疫保护性的基因。研究证明， 钩端螺旋体的外膜蛋白是钩端螺旋体的重要毒力因子， 由于其位置的特殊性， 在钩端螺旋体的黏附、 致病、 免疫保护等过程中可能起着重要作用。LipL32是钩端螺旋体中含量最多的外膜蛋白， 基因序列高度保守， 血清型之间的同源性高达93%～99%。已证明该蛋白具有增强钩端螺旋体溶血素的溶血功能， 被称为溶血素相关蛋白1（hap1， hemolysis associated protein1）[7]。2001年Branger等[8]构建腺病毒LipL32重组载体并免疫沙鼠， 结果沙鼠诱导产生了强烈的交叉免疫保护效应。为了避免腺病毒潜在的安全隐患， 作者又用PUC表达载体和LipL32构建重组载体对沙鼠进行DNA免疫， 结果也诱导产生了交叉免疫保护效应[9]。提示由该基因构建的DNA疫苗可能具有极高的开发和应用价值。本研究中即以LipL32基因为目的基因， 以pcDNA3.1为载体， 构建真核重组载体。由于载体pcDNA3.1含有CMV强启动子， 可以使目的基因得以有效地表达， 且其氨苄青霉素抗性基因中含有2个拷贝的免疫刺激DNA 序列( immunostimulatory sequence， ISS， 又称CpG DNA)， 该序列对DNA疫苗有很强的佐剂作用， 有利于提高机体的免疫效应。转染哺乳动物细胞时， 我们选用了转染效率高、 对细胞毒性小的脂质体转染法。转染细胞后通过G418压力筛选得到了稳定转染株， 有利于下一步对目的基因表达的鉴定。转染后的基因表达与否， 取决于表达的载体、 宿主细胞及目的蛋白的性质等。通过RTPCR和Western blot检测可分别从转录和翻译水平对目的基因的表达进行检测。本研究中通过RTPCR检测发现LipL32基因可以在COS7细胞中有效表达。另外， 在设计引物时， 我们去掉了LipL32基因的终止密码， 使得pcDNA3.1载体中的6个组氨酸得到表达， 有利于Western blot分析时用6个组氨酸标签蛋白的mAb进行检测， 提高了检测的特异性和敏感性。通过Western blot鉴定发现， 在Mr 30000左右有一特异性的阳性条带， 和预期目的蛋白的Mr吻合， 而在对照组未出现目的条带， 表明目的基因在细胞中得到了表达。
　　
　　综上所述， 我们成功地构建了赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞， 通过RTPCR和Western blot检测证实目的基因能在哺乳动物细胞中表达， 为下一步进行动物试验奠定了基础。

参考文献

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　　[6] 王 敏， 戴保民， 游自立， 等. 问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建[J]. 华西医科大学学报， 2002， 33（2）: 169-171.

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　　[9] Branger C， Chatrenet B， Gauvrit A， et al. Protection against Leptospira interrogans sensu Lato challenge by DNA immunization with the gene encoding hemolysinassociated protein1[J]. Infect Immun， 2005， 73(7): 4062-4069.