肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系

　　　　 作者：王平平， 高凤兰， 王健， 项桂菊， 胡孝彬

【摘要】 　　目的: 探讨肝硬化患者外周血IP10、 IP10 mRNA的表达及其与转氨酶水平的关系。方法: 筛选典型HBV感染后肝硬化患者， 以ELISA法检测患者血清IP10水平; Realtime PCR检测IP10 mRNA含量， 以lg cDNA/lg GAPDH代表其mRNA水平。结果: 肝硬化患者血清IP10及PBMC中IP10 mRNA水平分别为(299.3±77.2) ng/L、 0.7479±0.1495， 与对照组相比差异有统计学意义(P&<0.05， P&<0.01); ALT、 AST升高组外周血IP10及其mRNA升高， 与转氨酶正常组相比差异有统计学意义(P&<0.05， P&<0.01)。升高组中 IP10与ALT、 AST及ALT/AST比值存在相关(r=0.6284， 0.7162， 0.6970， P&<0.01)。结论: 肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达增高， 与肝细胞损伤程度密切相关， 在介导肝炎后肝硬化进展中起重要作用。

【关键词】 肝硬化 IP 10 mRNA PCR 外周血 转氨酶

　　肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生， 是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。IFNγ诱生蛋白10(interferon γinducible protein 10， IP10)是1985年Luster等用IFNγ刺激U937细胞株， 从cDNA基因库中筛选出， 属CXC家族ELR亚族， 可由IFNγ、 LPS等诱导产生， 介导Th1型炎症反应， 抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase， ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase， AST)及其AST/ALT比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解IP10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用， 筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者， 探讨其外周血IP10及其mRNA水平， 现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 FicollHypaque分离液购自上海试剂二厂; HBVDNA诊断试剂购自上海中亚基因研究所; ELISA法IP10试剂盒购自法国DLACLONE公司; TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司; cDNA合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司; 半自动生化仪ECOMF6124购自德国Eppendorf公司; EXL808全自动酶标仪和EXL50X全自动洗板机购自美国BioTek公司; LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenⅠ购自德国Roche公司; iCycle荧光实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。

　　1.2 检测对象 39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学医院收治的患者。其中男27例， 女12例， 年龄31.2～62.5岁， 平均44.5岁， ALT升高者18例， AST升高者24例， AST/ALT&>1.0者27例; 入选患者均为HBV感染者， 临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准， 病程均超过6个月， 无合并HAV、 HCV、 HDV、 HEV、 HIV感染的实验室依据， 无其他自身免疫性疾病， 3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组， 其中男16例， 女9例， 年龄20.3～42.9岁， 平均32.0岁。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本采集 分批采取患者晨起空腹静脉血5 mL， 分别置2支含肝素的无菌Eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC)， 普通管常规分离血清备检。

　　1.3.2 血清IP10检测 采用ELISA以试剂盒提供标准品绘制标准曲线， 每批检测设空白、 阴性、 阳性对照各2孔， 取100 μL待测血清和100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mAb)， 加至包被有趋化因子mAb的酶标反应板孔内， 37℃孵育1 h， PBS缓冲液洗涤5次， 加100 μL底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐， 室温30 min， 加2 mol/L h3SO4终止反应， 在EXL808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取A值， 每孔测定2次， 取均值， 依标准曲线确定血清IP10含量。IP10最低检测水平&<2 ng/L， 且批内和批间变异系数分别为&<5%和&<7%。

　　1.3.3 IP10 mRNA检测 采用Realtime PCR法。将分离的PBMC以RPMI1640培养液调整细胞数至(1～2)×109个/L悬液; 以TRIzol试剂抽提PBMC总RNA， 并逆转录为cDNA， 置-86℃冰箱备检。以SYBR GreenⅠ荧光标记法检测PCR产物， 总反应体系25 μL， 包括上下游引物各10 pmol， MgCl2 2.5 mmol/L， ExTaq 1.25 U， dNTP 2 mmol/L， 1×PCR buffer (500 mmol/L KCl， 100 mmol/L Tris， 20 μg/L gelatin， pH8.3)， 2×SYBRTM GreenⅠ液， 2 μL标准品或模板cDNA(1∶5稀释)。趋化因子引物设计参照Hirata等方法进行[2， 3]， IP10引物序列和扩增片段长度见表1。PCR扩增参数如下: 95℃预变性300 s， 然后95℃ 50 s， 55℃ 40 s， 72℃ 90 s共35个循环， 最后72℃延伸300 s。以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照， 以lg cDNA/lg GAPDH比值代表其mRNA水平。

　　表1 HBV及IP10引物序列和扩增片段长度（略）

　　1.3.4 标准品和标准曲线制备 以GAPDH为参照标准， 为确定定量扩增的效率和灵敏度， 将起始浓度为(106 copies/μL)的GAPDH， 按1∶10设6个梯度浓度， 即106 copies/μL、 105 copies/μL、 104 copies/μL、 103 copies/μL和102 copies/μL、 0。

　　1.4 统计学处理 IP10及其mRNA水平以x±s表示; 采用SPSS11.5软件进行t检验及相关分析， P&<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同转氨酶水平患者IP10表达 RTPCR显示肝硬化患者IP10表达(图1)， ELISA及Realtime PCR显示患者外周血IP10及其mRNA水平升高(P&<0.05或P&<0.01， 图2)， 依ALT、 AST水平将患者分为ALT、 AST正常组、 升高组， ALT、 AST升高组及AST/ALT&>1.0组外周血IP10及其mRNA水平高于转氨酶正常组， 差异亦有统计学意义(P&<0.05或P&<0.01， 图2)。

　　图1 PBMC中IP10表达（略）

　　1， 3， 5: GAPDH; 2， 4， 6: IP10; 1， 2: 对照组; 3， 4: 患者1（转氨酶正常）; 5， 6: 患者2（转氨酶升高）.

　　图2 IP10及其mRNA与转氨酶关系（略）

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 对照组或相应正常组.

　　2.2 IP10表达与转氨酶水平关系 ALT升高组患者血清IP10水平与ALT相关(r=0.6284， P&<0.01， 图3)， AST升高组血清IP10水平与AST明显相关(r=0.7162， P&<0.01， 图4)， AST/ALT比值升高组血清IP10水平与AST/ALT比值亦明显相关(r=0.6970， P&<0.01， 图5)。

　　图3 血清IP10水平与ALT相关性（略）

　　图4 血清IP10水平与AST相关性（略）

　　图5 血清IP10水平与AST/ALT相关性（略）

　　3 讨论
　　
　　IP10为CXC家族ELR-趋化因子， 对表达CXCR3受体的T淋巴细胞、 单核细胞等产生趋化游走。本研究结果显示， HBV感染后肝硬化患者外周血IP10及其mRNA水平增高， 与对照组相比， 差异有统计学意义(P&<0.01); PBMC内IP10 mRNA与血清IP10蛋白水平具有一致性， 提示 PBMC内IP10 mRNA可能是导致血清IP10水平升高的重要原因。Chuang等[4]研究显示IP10在原发性胆汁性肝硬变患者血浆中明显升高， 且和病情的严重程度相关。赵金红等[5]研究表明IP10在慢性乙肝中表达升高， 介导炎症反应， 参与乙型肝炎慢性化。HBV感染后肝硬化患者体内IP10表达增高可能的原因为: ①肝硬化患者存在一定程度的免疫功能紊乱， 肝清除能力下降， 内毒素生成增加， IL1和TNFα生成， TNFα、 IL1β、 和IFNγ通过IFN调节因子家族P48和2个STAT1形成命名为IFN激活因子3的三聚体， 与IFN刺激元件(ISRE)结合后， 从而驱动IP10 mRNA表达[6]。②肝硬化进程中，随着肝细胞的逐渐坏死， 胶原合成及胶原沉积不断增加， 在肝细胞炎性改变的基础上纤维化程度逐渐加重， 血清IP10水平升高。③肝硬化患者常伴有不同程度的门脉高压、 一定程度胃肠道菌群失调、 肠黏膜缺血缺氧， G-菌及其产物LPS等经破损黏膜入血， IP10分泌增加。④肝硬化患者全身高动力循环状态， 门脉高压， IP10可维持血管稳态， 可能作为免疫抑制剂， 发挥潜在的抗肿瘤作用。
　　
　　本实验结果显示， 肝硬化患者血清IP10含量与ALT水平呈正相关， 表明IP10水平在一定程度上反应肝硬化的炎症活动状况， 对了解肝硬化的进展有重要意义。HBV感染的肝细胞损伤主要来自宿主的免疫应答[7]， 机体内免疫复合物增加， 刺激机体产生大量TNFα、 IL6等前炎症因子， 这些因子本身可诱使肝脏微循环障碍， 血液通透性增加， 全身高动力循环， 肝细胞水肿变性， 继而坏死， ALT大量释放入血， IP10表达增强。王健等[8， 9]研究发现在慢性乙肝及丙型肝炎中IP10表达水平升高且和ALT表达水平呈正相关， 参与肝炎的慢性化进程。同时血清内IP10含量与AST水平呈正相关。一般情况下， AST升高幅度不及ALT， 随着HBV的感染持续， 肝硬化程度加重， 机体内毒素水平升高， 可直接杀伤正常和HBV感染肝细胞， 引起肝细胞黄疸， 血清胆红素升高， 形成肝脏炎症损害， 使IP10活性增加。Nishioji等[10]研究表明慢性乙肝中血清IP10水平较正常对照组明显升高， 且和血清转氨酶水平成正相关。AST/ALT是反映肝细胞损伤严重程度和评估预后发展的重要指标。本研究结果提示AST/ALT&>1.0组血清IP10水平明显高于AST/ALT≤1.0组。生理情况下AST/ALT比值约1.15， 肝细胞受损初期比值先下降， 随着细胞受损加重， 比值呈上升趋势， 肝硬化患者线粒体破坏， AST明显升高， AST/ALT&>1.0甚至&>2.0。IP10对Th1型细胞等有较强的趋化作用， 使其聚集到炎症部位， 在清除病毒的同时产生溶酶体酶、 氧自由基等炎性介质加重肝细胞损伤。

　　
　　综上所述， 在HBV感染后肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达水平升高， 与肝细胞损伤程度密切相关， 在清除病毒的同时加重炎症反应， 在肝炎后肝硬化发病机制中起重要作用。

参考文献

　　肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生， 是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。IFNγ诱生蛋白10(interferon γinducible protein 10， IP10)是1985年Luster等用IFNγ刺激U937细胞株， 从cDNA基因库中筛选出， 属CXC家族ELR亚族， 可由IFNγ、 LPS等诱导产生， 介导Th1型炎症反应， 抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase， ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase， AST)及其AST/ALT比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解IP10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用， 筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者， 探讨其外周血IP10及其mRNA水平， 现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 FicollHypaque分离液购自上海试剂二厂; HBVDNA诊断试剂购自上海中亚基因研究所; ELISA法IP10试剂盒购自法国DLACLONE公司; TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司; cDNA合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司; 半自动生化仪ECOMF6124购自德国Eppendorf公司; EXL808全自动酶标仪和EXL50X全自动洗板机购自美国BioTek公司; LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenⅠ购自德国Roche公司; iCycle荧光实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。

　　1.2 检测对象 39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学医院收治的患者。其中男27例， 女12例， 年龄31.2～62.5岁， 平均44.5岁， ALT升高者18例， AST升高者24例， AST/ALT&>1.0者27例; 入选患者均为HBV感染者， 临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准， 病程均超过6个月， 无合并HAV、 HCV、 HDV、 HEV、 HIV感染的实验室依据， 无其他自身免疫性疾病， 3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组， 其中男16例， 女9例， 年龄20.3～42.9岁， 平均32.0岁。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本采集 分批采取患者晨起空腹静脉血5 mL， 分别置2支含肝素的无菌Eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC)， 普通管常规分离血清备检。

　　1.3.2 血清IP10检测 采用ELISA以试剂盒提供标准品绘制标准曲线， 每批检测设空白、 阴性、 阳性对照各2孔， 取100 μL待测血清和100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mAb)， 加至包被有趋化因子mAb的酶标反应板孔内， 37℃孵育1 h， PBS缓冲液洗涤5次， 加100 μL底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐， 室温30 min， 加2 mol/L h3SO4终止反应， 在EXL808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取A值， 每孔测定2次， 取均值， 依标准曲线确定血清IP10含量。IP10最低检测水平&<2 ng/L， 且批内和批间变异系数分别为&<5%和&<7%。

　　1.3.3 IP10 mRNA检测 采用Realtime PCR法。将分离的PBMC以RPMI1640培养液调整细胞数至(1～2)×109个/L悬液; 以TRIzol试剂抽提PBMC总RNA， 并逆转录为cDNA， 置-86℃冰箱备检。以SYBR GreenⅠ荧光标记法检测PCR产物， 总反应体系25 μL， 包括上下游引物各10 pmol， MgCl2 2.5 mmol/L， ExTaq 1.25 U， dNTP 2 mmol/L， 1×PCR buffer (500 mmol/L KCl， 100 mmol/L Tris， 20 μg/L gelatin， pH8.3)， 2×SYBRTM GreenⅠ液， 2 μL标准品或模板cDNA(1∶5稀释)。趋化因子引物设计参照Hirata等方法进行[2， 3]， IP10引物序列和扩增片段长度见表1。PCR扩增参数如下: 95℃预变性300 s， 然后95℃ 50 s， 55℃ 40 s， 72℃ 90 s共35个循环， 最后72℃延伸300 s。以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照， 以lg cDNA/lg GAPDH比值代表其mRNA水平。

　　表1 HBV及IP10引物序列和扩增片段长度（略）

　　1.3.4 标准品和标准曲线制备 以GAPDH为参照标准， 为确定定量扩增的效率和灵敏度， 将起始浓度为(106 copies/μL)的GAPDH， 按1∶10设6个梯度浓度， 即106 copies/μL、 105 copies/μL、 104 copies/μL、 103 copies/μL和102 copies/μL、 0。

　　1.4 统计学处理 IP10及其mRNA水平以x±s表示; 采用SPSS11.5软件进行t检验及相关分析， P&<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同转氨酶水平患者IP10表达 RTPCR显示肝硬化患者IP10表达(图1)， ELISA及Realtime PCR显示患者外周血IP10及其mRNA水平升高(P&<0.05或P&<0.01， 图2)， 依ALT、 AST水平将患者分为ALT、 AST正常组、 升高组， ALT、 AST升高组及AST/ALT&>1.0组外周血IP10及其mRNA水平高于转氨酶正常组， 差异亦有统计学意义(P&<0.05或P&<0.01， 图2)。

　　图1 PBMC中IP10表达（略）

　　1， 3， 5: GAPDH; 2， 4， 6: IP10; 1， 2: 对照组; 3， 4: 患者1（转氨酶正常）; 5， 6: 患者2（转氨酶升高）.

　　图2 IP10及其mRNA与转氨酶关系（略）

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 对照组或相应正常组.

　　2.2 IP10表达与转氨酶水平关系 ALT升高组患者血清IP10水平与ALT相关(r=0.6284， P&<0.01， 图3)， AST升高组血清IP10水平与AST明显相关(r=0.7162， P&<0.01， 图4)， AST/ALT比值升高组血清IP10水平与AST/ALT比值亦明显相关(r=0.6970， P&<0.01， 图5)。

　　图3 血清IP10水平与ALT相关性（略）

　　图4 血清IP10水平与AST相关性（略）

　　图5 血清IP10水平与AST/ALT相关性（略）

　　3 讨论

　　IP10为CXC家族ELR-趋化因子， 对表达CXCR3受体的T淋巴细胞、 单核细胞等产生趋化游走。本研究结果显示， HBV感染后肝硬化患者外周血IP10及其mRNA水平增高， 与对照组相比， 差异有统计学意义(P&<0.01); PBMC内IP10 mRNA与血清IP10蛋白水平具有一致性， 提示 PBMC内IP10 mRNA可能是导致血清IP10水平升高的重要原因。Chuang等[4]研究显示IP10在原发性胆汁性肝硬变患者血浆中明显升高， 且和病情的严重程度相关。赵金红等[5]研究表明IP10在慢性乙肝中表达升高， 介导炎症反应， 参与乙型肝炎慢性化。HBV感染后肝硬化患者体内IP10表达增高可能的原因为: ①肝硬化患者存在一定程度的免疫功能紊乱， 肝清除能力下降， 内毒素生成增加， IL1和TNFα生成， TNFα、 IL1β、 和IFNγ通过IFN调节因子家族P48和2个STAT1形成命名为IFN激活因子3的三聚体， 与IFN刺激元件(ISRE)结合后， 从而驱动IP10 mRNA表达[6]。②肝硬化进程中，随着肝细胞的逐渐坏死， 胶原合成及胶原沉积不断增加， 在肝细胞炎性改变的基础上纤维化程度逐渐加重， 血清IP10水平升高。③肝硬化患者常伴有不同程度的门脉高压、 一定程度胃肠道菌群失调、 肠黏膜缺血缺氧， G-菌及其产物LPS等经破损黏膜入血， IP10分泌增加。④肝硬化患者全身高动力循环状态， 门脉高压， IP10可维持血管稳态， 可能作为免疫抑制剂， 发挥潜在的抗肿瘤作用。

　　本实验结果显示， 肝硬化患者血清IP10含量与ALT水平呈正相关， 表明IP10水平在一定程度上反应肝硬化的炎症活动状况， 对了解肝硬化的进展有重要意义。HBV感染的肝细胞损伤主要来自宿主的免疫应答[7]， 机体内免疫复合物增加， 刺激机体产生大量TNFα、 IL6等前炎症因子， 这些因子本身可诱使肝脏微循环障碍， 血液通透性增加， 全身高动力循环， 肝细胞水肿变性， 继而坏死， ALT大量释放入血， IP10表达增强。王健等[8， 9]研究发现在慢性乙肝及丙型肝炎中IP10表达水平升高且和ALT表达水平呈正相关， 参与肝炎的慢性化进程。同时血清内IP10含量与AST水平呈正相关。一般情况下， AST升高幅度不及ALT， 随着HBV的感染持续， 肝硬化程度加重， 机体内毒素水平升高， 可直接杀伤正常和HBV感染肝细胞， 引起肝细胞黄疸， 血清胆红素升高， 形成肝脏炎症损害， 使IP10活性增加。Nishioji等[10]研究表明慢性乙肝中血清IP10水平较正常对照组明显升高， 且和血清转氨酶水平成正相关。AST/ALT是反映肝细胞损伤严重程度和评估预后发展的重要指标。本研究结果提示AST/ALT&>1.0组血清IP10水平明显高于AST/ALT≤1.0组。生理情况下AST/ALT比值约1.15， 肝细胞受损初期比值先下降， 随着细胞受损加重， 比值呈上升趋势， 肝硬化患者线粒体破坏， AST明显升高， AST/ALT&>1.0甚至&>2.0。IP10对Th1型细胞等有较强的趋化作用， 使其聚集到炎症部位， 在清除病毒的同时产生溶酶体酶、 氧自由基等炎性介质加重肝细胞损伤。

　　综上所述， 在HBV感染后肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达水平升高， 与肝细胞损伤程度密切相关， 在清除病毒的同时加重炎症反应， 在肝炎后肝硬化发病机制中起重要作用。