在大剂量5氟尿嘧啶治愈荷瘤小鼠过程中外周血细胞的变化与肿瘤消退之间的相关性分析

　　　　 作者：李传刚， 李墨林*， 舒晓宏， 刘用楫， Michael Notter， 秦志海

【摘要】 　　目的: 观察在单一剂量5氟尿嘧啶(5FU)治愈荷瘤小鼠过程中外周血细胞数量的变化与肿瘤结节缩小之间的关系， 为进一步研究化疗治愈肿瘤的作用机制奠定基础。方法: 利用单一剂量5FU治愈荷瘤野生型C57BL/6小鼠模型， 荷瘤小鼠腹腔内分别注入25、 75、 135 mg/kg的5FU， 等量生理盐水对照， 确定5FU治愈肿瘤的量效关系。然后， 再取6只荷瘤小鼠， 分别在75 mg/kg 5FU治疗前3 d、 治疗后第1、 4、 7、 11、 15、 28天内眦静脉取血， 进行血常规检测， 分析外周血白细胞、 血红蛋白和血小板的变化与荷瘤小鼠肿瘤结节缩小之间的相关性。结果: 75、 135 mg/kg的5FU均可使荷瘤小鼠的肿瘤结节在治疗后1周内逐渐缩小、 直至消退， 因此5FU治愈荷瘤小鼠的最低有效量为75mg/kg。75mg/kg 5FU治疗后第1天外周血白细胞降为(5.0±1.1)×109/L， 并持续到化疗后第4天， 与治疗前(9.5±1.58)×109/L比较差异有统计学意义(P&<0.01); 5FU治疗后第7～15天外周血白细胞的数量升至化疗前水平， 随后逐渐下降， 在治疗后第28天降至（5.9±1.96）×109/L， 低于化疗前水平(P&<0.01)。Hb含量在5FU治疗后第1天也出现降低， 由化疗前的(133±7) g/L降为(112±9) g/L， 差异有统计学意义(P&<0.01)， 随后Hb含量持续在低水平， 治疗后15 d 逐渐恢复至化疗前水平。75 mg/kg的5FU对荷瘤小鼠血小板的抑制作用不明显， 反而在治疗后第1、 11天出现2次血小板一过性增高(P&<0.01)。结论: 75 mg/kg 5FU可引起外周血白细胞数和血红蛋白浓度的降低， 但对血小板的抑制作用不明显。5FU发挥抗肿瘤作用使荷瘤小鼠的肿瘤结节缩小与化疗后外周血白细胞和Hb的降低无关， 而与化疗后第1天血小板计数的增加有关。

【关键词】 5 氟尿嘧啶(5FU) 肿瘤治愈 淋巴瘤 C57BL/6小鼠 血小板计数

　　[Abstract] AIM: To investigate the relationship between the alterations of complete blood counts and tumor shrinkage during tumor rejection induced by a high dose of 5FU in C57BL/6 mice. METHODS: Wild type C57BL/6 tumorbearing mice were treated with different doses of 5FU intraperitoneally. 75 mg/kg 5FU was the minimal effective dose of 5FU that could cure the tumorbearing mice. Then another 6 tumorbearing mice were treated intraperitoneally with 5FU (75 mg/kg). Blood samples were obtained from orbital venous sinus on different days before and after 5FU treatment， and then complete blood counts were performed and the relationship between the alterations of blood counts and tumor shrinkage after 5FU treatment was analyzed. RESULTS: Tumor sizes decreased steadily and tumors disappeared within the first week after 5FU treatment; and at the same time 75 mg/kg 5FU also had side effects on peripherial blood cells. The number of WBC significantly decreased from the first day after 5FU treatment (P&<0.001). But during the 7 th to 15 th day the number of WBC rebounced back to normal level (P&>0.05). Later it decreased again and it couldn’t recover back to normal level at the 28th day after 5FU treatment (P&<0.01). The concentration of Hb decreased at the first day and lasted for 2 weeks (P&<0.01). It increased gradually back to normal in 2 weeks after 5FU treatment. The inhibitory effect of 5FU on platelets count was not obvious. The platelet count increased significantly at the first and at the 11th day after 5FU treatment respectively (P&<0.01). CONCLUSION: Tumor shrinkage after 5FU treatment is not related to the decreased number of WBC or RBC， but correlated with the increased number of platelet at the first day after 5FU treatment.

　　[Keywords]fluorouracil (5FU); tomor rejection; lymphoma; C57BL/6 mice; blood platelet count

　　5氟尿嘧啶(5FU)是临床常用的化疗药物， 属细胞周期特异性抗恶性肿瘤药物。近年研究发现5FU在体内可转变为5FU脱氧核苷酸、 5FU核苷等代谢产物， 从而影响或干扰DNA及蛋白质的合成， 但是其抗肿瘤作用的确切机制不清。我们在制备出单一剂量5FU(75mg/kg)治愈荷瘤野生型C57BL/6小鼠模型的基础上， 通过使用免疫缺陷动物发现5FU治愈肿瘤的过程需要机体T淋巴细胞的参与[1]。由于大剂量5FU在体内发挥抗肿瘤作用的同时也对机体产生剂量依赖性的毒副作用， 使骨髓抑制、 外周血象下降等， 而机体外周血象的变化与5FU化疗疗效的关系目前尚不清楚。本研究旨在检测大剂量5FU在治愈荷瘤小鼠过程中外周血细胞（白细胞、 红细胞和血小板）数量的动态变化， 探讨外周血细胞数量的变化与肿瘤结节缩小之间的关系， 分析以外周血细胞数量的变化作为预测荷瘤小鼠化疗疗效或机体抗肿瘤免疫力指标的可能性， 为进一步研究5FU抗肿瘤作用的细胞分子机制提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 野生型C57BL/6小鼠(H2b)， 体质量为20～30 g， 雌雄兼用， 性别和周龄相匹配， 饲养于SPF环境中。5氟尿嘧啶(5FU， Mr 130.08)， 购自Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 荷瘤C57BL/6小鼠动物模型的制备 参见文献[2]， 取1×105对数生长期的EL4肿瘤细胞接种在野生型C57BL/6小鼠（H2b）皮下， 7～9 d后皮下可及肿瘤结节， 从而建立荷EL4肿瘤的野生型C57BL/6小鼠模型。

　　1.2.2 大剂量5FU对荷瘤野生型C57BL/6小鼠的治疗作用 取皮下接种EL4细胞后12 d的荷瘤C57BL/6小鼠， 随机分组， 每组4只， 分别用25、 75、 135 mg/kg5FU单次腹腔内注射， 等量生理盐水对照。随后每1～3 d观察并记录1次5FU治疗后荷瘤小鼠肿瘤的平均直径（最大横径与垂直方向的横径的平均值）。当荷瘤小鼠的肿瘤直径接近或等于15 mm时视为治疗无效， 并处死小鼠。找出5FU治愈荷瘤小鼠所需5FU的最低治疗剂量。

　　1.2.3 单一剂量5FU治愈荷瘤小鼠过程中外周血细胞的动态变化 取6只野生型荷瘤C57BL/6小鼠， 分别在75mg/kg5FU治疗前3 d、 治疗后第1、 4、 7、 11、 15、 28天乙醚吸入麻醉后内眦静脉取血[3]少量， 1 g/L肝素等量混合后用全自动血细胞仪进行血常规的检测， 了解5FU治疗前后外周血白细胞、 血红蛋白和血小板的动态变化。

　　1.2.4 统计学处理 计量资料采用x±s表示， 组内比较用随机区组方差分析及两两比较。

　　2 结果

　　2.1 单一剂量5FU治愈荷瘤小鼠的量效关系 所有接受5FU治疗的荷瘤小鼠无急性中毒致死发生。不同剂量的5FU单次治疗后荷瘤小鼠肿瘤结节直径的变化见表1。由表1可见， 75和135 mg/kg的5FU都能使荷瘤小鼠的肿瘤结节在5FU治疗后1周左右消退， 但肿瘤结节消退的速率随5FU治疗剂量的增加而加快， 因此， 我们认为5FU治愈荷瘤小鼠的最低有效剂量为75 mg/kg。

　　表1 不同剂量5FU治疗后各组荷瘤小鼠肿瘤结节大小的变化（略）

　　Tab 1 Dynamicchangesoftumor’ssizeintumorbearingC57BL/6 mice after different doses of 5FU treatment

　　2.2 75 mg/kg5FU对荷瘤小鼠外周血细胞的影响75 mg/kg 5FU治疗前后荷瘤小鼠外周血白细胞、 血红蛋白和血小板的动态变化见表2。由表2可见， 75 mg/kg的5FU对外周血象的影响使白细胞的数量在治疗后第1天就降为(5.0±1.1)×109/L， 并持续到化疗后第4天， 与治疗前(9.5±1.58)×109/L比较差异有统计学意义(P&<0.01); 治疗后第7～15天白细胞的数量有所回升， 与化疗前比较差异无统计学意义(P&>0.05); 但在治疗后第28天外周血白细胞的数量降为（5.9±1.96）×109/L， 低于化疗前水平(P&<0.01)， 提示75 mg/kg5FU对荷瘤小鼠外周血白细胞有抑制作用。5FU治疗后荷瘤小鼠外周血血红蛋白的浓度也在治疗后第1天下降， 由化疗前的（133±7）g/L降为(112±9)g/L， 差异有统计学意义(P&<0.01)， 以后均持续在低水平波动; 从治疗后第15天始Hb的浓度逐渐上升， 与化疗前Hb浓度比较， 差异无统计学意义(P&>0.05）。75 mg/kg 的5FU对荷瘤小鼠血小板的抑制作用不明显， 反而在5FU用药后第1、 11天出现2次血小板一过性增高， 分别为(1553±16)×109/L、 (2435±473)×109/L， 与化疗前血小板计数(1254±82)×109/L比较， 差异具有统计学意义(P≤0.001)。

　　表2 75 mg/kg5FU对荷瘤小鼠外周血细胞的影响（略）

　　Tab 2 The side effects of 5FU on peripherial blood cells of tumorbearing mice

　　dP&<0.01 vs 3 d before 5FU treatment.

　　3 讨论
　　
　　应用细胞毒性化疗药物进行系统或大剂量化疗是目前各种晚期恶性肿瘤患者有效治疗的基础， 但是化疗药物抗肿瘤作用的确切机制不清。同时， 尽管临床研究发现化疗的疗效与肿瘤患者机体的免疫功能密切相关， 但到目前为止临床上还没有可用来代表机体抗肿瘤免疫力强弱的指标。因此， 通过动物实验了解在大剂量化疗治愈肿瘤过程中荷瘤小鼠肿瘤结节直径的变化与外周血细胞数量变化之间的相关性， 对于寻找与机体抗肿瘤免疫力或化疗疗效密切相关的临床检测指标、 指导临床用药具有重要的指导意义。
　　
　　本研究证实75 mg/kg5FU治愈荷瘤小鼠属于大剂量化疗治愈肿瘤的动物模型。75 mg/kg的5FU不但对荷瘤小鼠的肿瘤有直接杀伤作用， 而且对机体增殖迅速的外周血细胞也有抑制作用， 具体表现在: 75 mg/kg5FU治疗后1 d外周血白细胞就出现降低(P&<0.01)， 直至到5FU治疗后第28天白细胞仍不能恢复到化疗前水平（P&<0.01）， 说明75 mg/kg5FU对外周血白细胞的抑制出现的时间早、 持续的时间长。虽然75 mg/kg5FU治疗后外周血白细胞降低， 但荷瘤小鼠的肿瘤仍被治愈， 说明5FU治疗后外周血白细胞的降低与肿瘤结节的消退无关。5FU治疗后第7～15天白细胞计数回升达化疗前水平， 其发生机制不清。根据5FU在体内的药代动力学变化呈二室开放模型[4]的特点和药理学有关药物剂量效应关系的理论， 75 mg/kg5FU在治疗后第7～15天其在体内的含量很低， 基本上不再有抗肿瘤的活性; 同时， 既往我们应用T淋巴细胞缺陷的荷瘤裸鼠进行体内实验， 结果也发现75 mg/kg5FU治疗后第7～15天正是未被5FU杀伤、 残留的存活肿瘤细胞复发的时间[1]， 由此我们可以推测5FU治疗后第7～15天白细胞计数的回升可能与5FU治疗后肿瘤细胞的凋亡或坏死激活了荷瘤小鼠肿瘤局部或全身的免疫反应， 因此， 化疗后第2周外周血白细胞数量的增加可能与机体抗肿瘤免疫力的提高有关。75 mg/kg5FU对外周血红细胞有抑制作用， 表现在5FU治疗后第1天就出现外周血Hb浓度的降低， 并持续到化疗后第11天， 因此， 5FU治疗后外周血红细胞的抑制与化疗疗效即荷瘤小鼠肿瘤结节的消退无关。由于75 mg/kg5FU治疗属于大剂量化疗， 而大剂量化疗常引起骨髓抑制、 外周血象下降、 外周血血小板计数降低。但是， 本研究发现在75 mg/kg5FU治疗后第1、 11天外周血血小板计数出现2 次“一过性”升高， 与化疗前血小板计数比较， 差异具有统计学意义(P&<0.01)， 但其发生的原因和机制尚不清楚。临床上血小板计数是用来反映血小板生成与衰亡的指标，血小板计数的升高或降低除与血液性疾病关系密切外， 还和出凝血有关。但是， 血小板增多症与恶性肿瘤之间的关系早在1964年就由Leven所报道， 临床观察发现单项血小板计数升高或无法解释的血小板增高可能是尚未确诊的早期癌症的首发征象， 血小板数目的变化可作为肿瘤发生、 发展、 疗效及预后判断的参考指标[5-8]。此外， 动物实验发现机体免疫状况同血小板计数呈负相关[9]， 因此， 我们认为75 mg/kg5FU治疗后肿瘤结节的消退或肿瘤的治愈与血小板计数的增高有关， 但化疗后外周血小板计数的增加能否作为判断化疗疗效及化疗后机体免疫功能状态的参考指标有待于进一步探索。

参考文献

　　[1] 李墨林， 李传刚， 舒晓宏， 等. 化疗治愈荷瘤小鼠模型的建立及氟尿嘧啶抑瘤作用的免疫机制[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(11): 1010-1013.

　　[2] 李墨林， 李传刚， 舒晓宏， 等. 荷EL4肿瘤小鼠模型的建立及美法仑抑瘤作用免疫机制的探讨[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(2): 235-238.

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　　[6] 李墨林， 蔡桂凤， 朱 敏， 等. 卵巢恶性肿瘤患者血浆纤维蛋白原及血小板四项参数检测的临床意义[J]. 大连医科大学学报， 2004， 26(4): 280-283.

　　[7] Lerner DL， Walsh CS， Cass I， et al. The prognostic significance of thrombocytosis in uterine papillary serous carcinomas[J]. Gynecol Oncol， 2007， 104(1): 91-94.

　　[8] Iwasaki A， Hamanaka W， Harnada T， et al. Significance of platelet counts in patients who underwent surgical treatment for lung metastasis[J]. Int Surg， 2007， 92(2): 103-109.

　　[9] 赵建增， 刘 丽， 梅英杰. 外源血小板生成素基因体内导入对循环免疫因子水平的影响[J]. 中国免疫学杂志， 1999， 15(3): 103-105.

　　2.2 75 mg/kg5FU对荷瘤小鼠外周血细胞的影响75 mg/kg 5FU治疗前后荷瘤小鼠外周血白细胞、 血红蛋白和血小板的动态变化见表2。由表2可见， 75 mg/kg的5FU对外周血象的影响使白细胞的数量在治疗后第1天就降为(5.0±1.1)×109/L， 并持续到化疗后第4天， 与治疗前(9.5±1.58)×109/L比较差异有统计学意义(P&<0.01); 治疗后第7～15天白细胞的数量有所回升， 与化疗前比较差异无统计学意义(P&>0.05); 但在治疗后第28天外周血白细胞的数量降为（5.9±1.96）×109/L， 低于化疗前水平(P&<0.01)， 提示75 mg/kg5FU对荷瘤小鼠外周血白细胞有抑制作用。5FU治疗后荷瘤小鼠外周血血红蛋白的浓度也在治疗后第1天下降， 由化疗前的（133±7）g/L降为(112±9)g/L， 差异有统计学意义(P&<0.01)， 以后均持续在低水平波动; 从治疗后第15天始Hb的浓度逐渐上升， 与化疗前Hb浓度比较， 差异无统计学意义(P&>0.05）。75 mg/kg 的5FU对荷瘤小鼠血小板的抑制作用不明显， 反而在5FU用药后第1、 11天出现2次血小板一过性增高， 分别为(1553±16)×109/L、 (2435±473)×109/L， 与化疗前血小板计数(1254±82)×109/L比较， 差异具有统计学意义(P≤0.001)。

　　表2 75 mg/kg5FU对荷瘤小鼠外周血细胞的影响（略）

　　Tab 2 The side effects of 5FU on peripherial blood cells of tumorbearing mice

　　dP&<0.01 vs 3 d before 5FU treatment.

　　3 讨论
　　
　　应用细胞毒性化疗药物进行系统或大剂量化疗是目前各种晚期恶性肿瘤患者有效治疗的基础， 但是化疗药物抗肿瘤作用的确切机制不清。同时， 尽管临床研究发现化疗的疗效与肿瘤患者机体的免疫功能密切相关， 但到目前为止临床上还没有可用来代表机体抗肿瘤免疫力强弱的指标。因此， 通过动物实验了解在大剂量化疗治愈肿瘤过程中荷瘤小鼠肿瘤结节直径的变化与外周血细胞数量变化之间的相关性， 对于寻找与机体抗肿瘤免疫力或化疗疗效密切相关的临床检测指标、 指导临床用药具有重要的指导意义。
　　
　　本研究证实75 mg/kg5FU治愈荷瘤小鼠属于大剂量化疗治愈肿瘤的动物模型。75 mg/kg的5FU不但对荷瘤小鼠的肿瘤有直接杀伤作用， 而且对机体增殖迅速的外周血细胞也有抑制作用， 具体表现在: 75 mg/kg5FU治疗后1 d外周血白细胞就出现降低(P&<0.01)， 直至到5FU治疗后第28天白细胞仍不能恢复到化疗前水平（P&<0.01）， 说明75 mg/kg5FU对外周血白细胞的抑制出现的时间早、 持续的时间长。虽然75 mg/kg5FU治疗后外周血白细胞降低， 但荷瘤小鼠的肿瘤仍被治愈， 说明5FU治疗后外周血白细胞的降低与肿瘤结节的消退无关。5FU治疗后第7～15天白细胞计数回升达化疗前水平， 其发生机制不清。根据5FU在体内的药代动力学变化呈二室开放模型[4]的特点和药理学有关药物剂量效应关系的理论， 75 mg/kg5FU在治疗后第7～15天其在体内的含量很低， 基本上不再有抗肿瘤的活性; 同时， 既往我们应用T淋巴细胞缺陷的荷瘤裸鼠进行体内实验， 结果也发现75 mg/kg5FU治疗后第7～15天正是未被5FU杀伤、 残留的存活肿瘤细胞复发的时间[1]， 由此我们可以推测5FU治疗后第7～15天白细胞计数的回升可能与5FU治疗后肿瘤细胞的凋亡或坏死激活了荷瘤小鼠肿瘤局部或全身的免疫反应， 因此， 化疗后第2周外周血白细胞数量的增加可能与机体抗肿瘤免疫力的提高有关。75 mg/kg5FU对外周血红细胞有抑制作用， 表现在5FU治疗后第1天就出现外周血Hb浓度的降低， 并持续到化疗后第11天， 因此， 5FU治疗后外周血红细胞的抑制与化疗疗效即荷瘤小鼠肿瘤结节的消退无关。由于75 mg/kg5FU治疗属于大剂量化疗， 而大剂量化疗常引起骨髓抑制、 外周血象下降、 外周血血小板计数降低。但是， 本研究发现在75 mg/kg5FU治疗后第1、 11天外周血血小板计数出现2 次“一过性”升高， 与化疗前血小板计数比较， 差异具有统计学意义(P&<0.01)， 但其发生的原因和机制尚不清楚。临床上血小板计数是用来反映血小板生成与衰亡的指标，血小板计数的升高或降低除与血液性疾病关系密切外， 还和出凝血有关。但是， 血小板增多症与恶性肿瘤之间的关系早在1964年就由Leven所报道， 临床观察发现单项血小板计数升高或无法解释的血小板增高可能是尚未确诊的早期癌症的首发征象， 血小板数目的变化可作为肿瘤发生、 发展、 疗效及预后判断的参考指标[5-8]。此外， 动物实验发现机体免疫状况同血小板计数呈负相关[9]， 因此， 我们认为75 mg/kg5FU治疗后肿瘤结节的消退或肿瘤的治愈与血小板计数的增高有关， 但化疗后外周血小板计数的增加能否作为判断化疗疗效及化疗后机体免疫功能状态的参考指标有待于进一步探索。

参考文献

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