可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养中细胞因子表达的影响

　　　　 作者：王炯坤， 邢飞跃， 季煜华， 方志远， 郭中锋， 潘山

【摘要】 　　目的: 研究可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养体系中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα表达水平的影响。方法: 应用IL4和GMCSF诱导培养小鼠骨髓细胞， 流式细胞术检测髓系树突状细胞(DC)分化标志CD11c; 将等量的淋巴细胞与之共培养， ELISA检测共培养上清TGFβ1的含量， Luminex100检测IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα的含量。结果: 可溶性Jagged1/Fc处理组TGFβ1和IL10的水平与DAPT对照组之间无统计学意义(P&>0.05)， 而IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα的水平升高(P&<0.05)。结论: Jagged1/Fc能促进DCT细胞相互作用导致IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα的水平上调。

【关键词】 Jagged1/Fc 细胞因子 树突状细胞 T细胞

　　树突状细胞(dendritic cell， DC)是专职的抗原提呈细胞， 能够诱导初始T细胞分化为不同类型的效应T细胞， 以引起不同的免疫反应。通过细胞膜表面的配体受体的相互作用以及分泌的细胞因子， DC和T细胞共同调控着适应性免疫反应的方向。Jagged1是哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一， 与T细胞受体Notch结合后， 激活Notch信号通路， 从而影响外周T细胞的分化。目前尚不清楚Notch究竟是如何调控外周T细胞分化。虽然有些报道认为在抗原提呈细胞所过表达的Jagged1能通过Notch信号通路诱导CD4+初始T细胞分化为调节性T细胞， 但是Amsen的研究表明Jagged1Notch的相互作用实际上促进了CD4+初始T细胞向Th3细胞分化[1]。此外， 也有报道认为Notch信号通路的激活并非CD4+初始T细胞分化所必需的， 在抗原提呈细胞上过表达Jagged1所引起的免疫耐受可能是抑制T细胞的增殖、 活化以及相关细胞因子的产生的结果[2， 3]。尽管对于Jagged1在T细胞分化中的作用还未达成一致的意见， 但是从已有的研究来看Jagged1确实能够通过Notch信号通路影响T细胞的活化、增殖以及相关细胞因子的产生。鉴于从细胞因子水平， 在国内外尚无利用可溶性Jagged1/Fc对外周T细胞分化的影响进行比较全面研究的报道。因此， 我们通过研究可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养体系中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα等细胞因子表达的作用，旨在探讨Jagged1和外周T细胞分化的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性SPF级C57BL/6小鼠(8周龄， 质量18～22g)， 购自广东省医学实验动物中心。RPMI1640培养液、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)为GibcoBRL公司产品。L谷氨酰胺、 β巯基乙醇和DAPT均购自Sigma公司。rmIL4、 rmGMCSF购自Peprotech公司。Jagged1/Fc为R&&D Systems公司。TGFβ1试剂盒、 多重细胞因子试剂盒购自UPSDATE公司。680型酶标仪购自BIORAD公司。LuminexTM100蛋白液相分析仪购自Luminex公司。FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 淋巴细胞的制备 将C57BL/6小鼠断髓处死， 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结， 去除被膜， 机械研磨， 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞， 用冷PBS 1200 r/min离心5 min。洗涤细胞2次， 细胞重悬于100 mL/L胎牛血清RPMI1640培养液中， 调整细胞密度为1×107/L。

　　1.2.2 骨髓细胞的制备 参照Lutz MB法进行， 并略加改良。取C57BL/6小鼠断颈处死， 无菌分离完整的股骨及胫骨， 剪断骨头两端， 用PBS冲洗骨髓腔， 充分吹打骨髓细胞团， 收集骨髓细胞悬液离心（300 g， 5 min）。用PBS重悬后加入红细胞裂解液， 37℃ 避光作用8 min后PBS洗2次（300 g， 5 min）。细胞重悬于含100 mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养液中， 调整细胞密度为2×109/L。

　　1.2.3 细胞共培养 取上述制备的骨髓细胞， 按1×107细胞数/孔铺于6孔培养板中， 第0、 3、 6天每孔加入2.5 μg/L rmIL4和10 μg/L rmGMCSF。第9天取上述C57BL/6小鼠淋巴细胞， 按等细胞数加入骨髓细胞中， 设Jagged1/Fc组和DAPT对照组（即DAPT加入2 h后， 再加Jagged1/Fc）， 每组各6个重复， 于当日和隔日分别加入500μg/LJagged1/Fc 和5 μmol/L DAPT， 2 d后取细胞培养上清分装、 置-75℃下保存供Luminex和ELISA检测用。

　　1.2.4 流式细胞术检测与分析 分别于第0、 6、 9天收集经IL4和GMCSF诱导生长的细胞， 300 g离心5 min去上清， PBS洗涤（300 g， 5 min） 1次， 加入antiCD11cFITC， 0.25 μg/106细胞， 混匀后4℃下避光放置30 min。PBS洗涤（300 g， 5 min） 2次， 用FACSCalibur流式细胞仪检测， 所获数据在CELLQuest软件上分析。

　　1.2.5 细胞因子检测 (1)取上述细胞培养上， 采用双抗夹心ELISA检测TGFβ1， 具体操作按说明书进行， 最后经680型酶标仪在450 nm处读取吸光度值， 并在标准曲线上查出其浓度值。(2)用试剂盒检测多重细胞因子， 在PVDF膜96孔板中依次加入50 μL RPMI1640（空白孔）、 以RPMI1640培养液倍比稀释的标准品和细胞培养上清， 然后每孔加入分别能与IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα结合的5种微珠混合物， 避光振荡孵育2 h。将板置于真空架上， 液体经孔底部PVDF膜被去除， 加入75 μL分析缓冲液振荡重悬微球， 并加入25 μL biotin标记的抗以上各种细胞因子的抗体混合物， 避光振荡孵育2 h。然后加入25 μL StreptavidinPE继续孵育30 min， 最后加入25 μL终止液孵育5 min， 真空除去各孔液体。以125 μL分析缓冲液重悬微珠， 用LuminexTM100蛋白液相分析仪检测， 应用MasterPlexTMQT多元数据分析软件绘制标准曲线， 并计算出每个样品所含的5种细胞因子的浓度。

　　1.2.6 统计学处理 数据用x±s表示， 采用t检验进行统计分析， P&<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 诱导髓系DC分化 经流式细胞术检测， 结果显示: 第0、 6和9天的CD11c mAb的阳性率分别为3.2%、 89.5%和91.1%， 表明经细胞因子诱导后获得了具有典型DC表型特征的细胞（图1）。

　　图1 GMCSF 和IL4诱导培养的骨髓细胞表面分子CD11c的表达（略）

　　2.2 Jagged1/Fc影响DCT细胞分泌细胞因子 Jagged1/Fc加入DCT细胞共培养体系中， 2 d后收集细胞上清并测定培养上清中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα的表达水平。作为对照组， 先将阻断剂DAPT加入DCT细胞共培养体系作用2 h后， 再加入Jagged1/Fc， 2 d后收集并测定上述细胞因子。与DAPT组比较， Jagged1/Fc可促进DCT细胞共培养体系分泌IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα， 但TGFβ1和IL10的表达在两组之间无统计学意义（表1）。

　　表1 可溶性Jaggde1/Fc对DCT细胞共培养中细胞因子表达水平的影响（略）

　　aP&<0.05 vs DAPT处理组.

　　3 讨论
　　
　　DC和T细胞膜表面的受体配体的相互作用及其微环境中的细胞因子类型是T细胞分化的两个主要因素。Notch是细胞表面的受体， 广泛表达于外周免疫系统的各种细胞， 在外周CD4+T细胞的活化、 增殖和分化中发挥着重要的作用。在哺乳动物中， 现已发现4种Notch受体（Notch1Notch4）， 以及5种Notch受体的配体包括Jagged1、 Jagged2、 DLL1、 DDL3和DDL4。Notch的活化需要经过两步蛋白酶水解过程剪切全长的Notch受体从而释放出Notch的胞内段结构域， 介导这一过程的蛋白酶之一为γ分泌酶。DAPT作为Notch信号通路的阻断剂， 能够特异地阻断γ分泌酶的作用， 从而阻止Notch的活化[4]。由于我们所利用的DC未经LPS刺激， 几乎不表达Notch受体的配体[5]。因此， 我们可以先用DAPT处理， 使Notch信号通路不受Jagged1活化， 之后再将Jagged1加入到DAPT处理组中作为实验对照组。虽然许多证据表明Jagged1Notch信号通路能影响外周T细胞的分化， 但是其中的确切机制还有待进一步研究。为此， 本实验通过研究Jagged1/Fc对DC和T细胞共培养体系所分泌的细胞因子的影响， 探讨Jagged1和外周T细胞分化之间的关系。
　　
　　TGFβ和IL10是在免疫抑制中起重要作用的细胞因子。其中， TGFβ是Foxp3+调节性T细胞发育所必需的， 而 IL10则可以诱导幼稚T细胞分化成为Foxp3-调节性T细胞（Tr1）。在Notch信号通路方面， TGFβ信号转导通过Smad3与Notch1的胞内段的直接作用， 实现两个信号通路之间的相互“对话”[6]， 而Notch1信号通路的激活则可以提高CD4+T细胞分泌IL10。然而， Jagged1/Fc对共培养的细胞的TGFβ1和IL10表达水平均无显著影响。结果表明， 可能是Notch1的其他配体而非Jagged1会影响IL10的表达。
　　
　　IL4和IFNγ分别是Th1与Th3所分泌的最典型的细胞因子。IL4通过激活GATA3和STAT6使幼稚T细胞向Th3分化， 而IFNγ通过激活Tbet和STAT1促进Th1的分化[7]。然而， IL4和IFNγ均抑制Th17的分化。Amsen等证实在抗原提呈细胞过表达Jagged1促进IL4的分泌， 而抑制IFNγ的产生[5]。相反， Palaga等发现在表达Notch1反义基因的小鼠中， 外周T细胞分泌的IFNγ明显减少[8]。本实验中， Jagged1/Fc能同时促进DCT细胞共培养体系分泌IL4和IFNγ。因此， Notch的激活可能在Th1和Th3的分化上具有双向调节作用。
　　
　　IL2主要来自于活化的CD4+T细胞， 是体内Th3分化所不可缺少的细胞因子[9]。然而， IL2能通过活化STAT5负向调控Th17的分化， 并且在缺陷IL2的小鼠中， IL17的表达量增加[10]。Jagged1/Fc促进DCT细胞共培养体系分泌IL2， 提示Jagged1可能影响Th3和Th17的发育。

　　
　　TNFα是体内最重要的致炎症因子之一， 能够诱导IL6和IL1β的产生， 从而促进Th1和Th17的免疫反应[11]。有研究表明， TNFα能促进类风湿关节炎滑膜细胞中Notch1胞内段的核转位， 并且阻断Notch1信号通路也会使TNFα的表达量降低[12]。与此相一致， Jagged1/Fc能促进DCT细胞共培养体系分泌TNFα。
　　
　　由于IL4和IL2表达量的增加对Th3的分化起正调控作用， 则可能不利于Th1和Th17的分化; 而IFNγ和TNFα分泌水平的提高会促进Th1的分化， 却对Th3的分化起到制约作用。可见， Th1、 Th3和Th173种细胞的分化存在相互制约的关系， 所以Jagged1可能在调控Th1、 Th3和Th17的免疫反应的平衡上具有一定的作用。

参考文献

　　树突状细胞(dendritic cell， DC)是专职的抗原提呈细胞， 能够诱导初始T细胞分化为不同类型的效应T细胞， 以引起不同的免疫反应。通过细胞膜表面的配体受体的相互作用以及分泌的细胞因子， DC和T细胞共同调控着适应性免疫反应的方向。Jagged1是哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一， 与T细胞受体Notch结合后， 激活Notch信号通路， 从而影响外周T细胞的分化。目前尚不清楚Notch究竟是如何调控外周T细胞分化。虽然有些报道认为在抗原提呈细胞所过表达的Jagged1能通过Notch信号通路诱导CD4+初始T细胞分化为调节性T细胞， 但是Amsen的研究表明Jagged1Notch的相互作用实际上促进了CD4+初始T细胞向Th3细胞分化[1]。此外， 也有报道认为Notch信号通路的激活并非CD4+初始T细胞分化所必需的， 在抗原提呈细胞上过表达Jagged1所引起的免疫耐受可能是抑制T细胞的增殖、 活化以及相关细胞因子的产生的结果[2， 3]。尽管对于Jagged1在T细胞分化中的作用还未达成一致的意见， 但是从已有的研究来看Jagged1确实能够通过Notch信号通路影响T细胞的活化、增殖以及相关细胞因子的产生。鉴于从细胞因子水平， 在国内外尚无利用可溶性Jagged1/Fc对外周T细胞分化的影响进行比较全面研究的报道。因此， 我们通过研究可溶性Jagged1/Fc对DCT细胞共培养体系中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα等细胞因子表达的作用，旨在探讨Jagged1和外周T细胞分化的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性SPF级C57BL/6小鼠(8周龄， 质量18～22g)， 购自广东省医学实验动物中心。RPMI1640培养液、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)为GibcoBRL公司产品。L谷氨酰胺、 β巯基乙醇和DAPT均购自Sigma公司。rmIL4、 rmGMCSF购自Peprotech公司。Jagged1/Fc为R&&D Systems公司。TGFβ1试剂盒、 多重细胞因子试剂盒购自UPSDATE公司。680型酶标仪购自BIORAD公司。LuminexTM100蛋白液相分析仪购自Luminex公司。FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 淋巴细胞的制备 将C57BL/6小鼠断髓处死， 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结， 去除被膜， 机械研磨， 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞， 用冷PBS 1200 r/min离心5 min。洗涤细胞2次， 细胞重悬于100 mL/L胎牛血清RPMI1640培养液中， 调整细胞密度为1×107/L。

　　1.2.2 骨髓细胞的制备 参照Lutz MB法进行， 并略加改良。取C57BL/6小鼠断颈处死， 无菌分离完整的股骨及胫骨， 剪断骨头两端， 用PBS冲洗骨髓腔， 充分吹打骨髓细胞团， 收集骨髓细胞悬液离心（300 g， 5 min）。用PBS重悬后加入红细胞裂解液， 37℃ 避光作用8 min后PBS洗2次（300 g， 5 min）。细胞重悬于含100 mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养液中， 调整细胞密度为2×109/L。

　　1.2.3 细胞共培养 取上述制备的骨髓细胞， 按1×107细胞数/孔铺于6孔培养板中， 第0、 3、 6天每孔加入2.5 μg/L rmIL4和10 μg/L rmGMCSF。第9天取上述C57BL/6小鼠淋巴细胞， 按等细胞数加入骨髓细胞中， 设Jagged1/Fc组和DAPT对照组（即DAPT加入2 h后， 再加Jagged1/Fc）， 每组各6个重复， 于当日和隔日分别加入500μg/LJagged1/Fc 和5 μmol/L DAPT， 2 d后取细胞培养上清分装、 置-75℃下保存供Luminex和ELISA检测用。

　　1.2.4 流式细胞术检测与分析 分别于第0、 6、 9天收集经IL4和GMCSF诱导生长的细胞， 300 g离心5 min去上清， PBS洗涤（300 g， 5 min） 1次， 加入antiCD11cFITC， 0.25 μg/106细胞， 混匀后4℃下避光放置30 min。PBS洗涤（300 g， 5 min） 2次， 用FACSCalibur流式细胞仪检测， 所获数据在CELLQuest软件上分析。

　　1.2.5 细胞因子检测 (1)取上述细胞培养上， 采用双抗夹心ELISA检测TGFβ1， 具体操作按说明书进行， 最后经680型酶标仪在450 nm处读取吸光度值， 并在标准曲线上查出其浓度值。(2)用试剂盒检测多重细胞因子， 在PVDF膜96孔板中依次加入50 μL RPMI1640（空白孔）、 以RPMI1640培养液倍比稀释的标准品和细胞培养上清， 然后每孔加入分别能与IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ和TNFα结合的5种微珠混合物， 避光振荡孵育2 h。将板置于真空架上， 液体经孔底部PVDF膜被去除， 加入75 μL分析缓冲液振荡重悬微球， 并加入25 μL biotin标记的抗以上各种细胞因子的抗体混合物， 避光振荡孵育2 h。然后加入25 μL StreptavidinPE继续孵育30 min， 最后加入25 μL终止液孵育5 min， 真空除去各孔液体。以125 μL分析缓冲液重悬微珠， 用LuminexTM100蛋白液相分析仪检测， 应用MasterPlexTMQT多元数据分析软件绘制标准曲线， 并计算出每个样品所含的5种细胞因子的浓度。

　　1.2.6 统计学处理 数据用x±s表示， 采用t检验进行统计分析， P&<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 诱导髓系DC分化 经流式细胞术检测， 结果显示: 第0、 6和9天的CD11c mAb的阳性率分别为3.2%、 89.5%和91.1%， 表明经细胞因子诱导后获得了具有典型DC表型特征的细胞（图1）。

　　图1 GMCSF 和IL4诱导培养的骨髓细胞表面分子CD11c的表达（略）

　　2.2 Jagged1/Fc影响DCT细胞分泌细胞因子 Jagged1/Fc加入DCT细胞共培养体系中， 2 d后收集细胞上清并测定培养上清中TGFβ1、 IL10、 IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα的表达水平。作为对照组， 先将阻断剂DAPT加入DCT细胞共培养体系作用2 h后， 再加入Jagged1/Fc， 2 d后收集并测定上述细胞因子。与DAPT组比较， Jagged1/Fc可促进DCT细胞共培养体系分泌IL4、 IL2、 IFNγ及TNFα， 但TGFβ1和IL10的表达在两组之间无统计学意义（表1）。

　　表1 可溶性Jaggde1/Fc对DCT细胞共培养中细胞因子表达水平的影响（略）

　　aP&<0.05 vs DAPT处理组.

　　3 讨论

　　DC和T细胞膜表面的受体配体的相互作用及其微环境中的细胞因子类型是T细胞分化的两个主要因素。Notch是细胞表面的受体， 广泛表达于外周免疫系统的各种细胞， 在外周CD4+T细胞的活化、 增殖和分化中发挥着重要的作用。在哺乳动物中， 现已发现4种Notch受体（Notch1Notch4）， 以及5种Notch受体的配体包括Jagged1、 Jagged2、 DLL1、 DDL3和DDL4。Notch的活化需要经过两步蛋白酶水解过程剪切全长的Notch受体从而释放出Notch的胞内段结构域， 介导这一过程的蛋白酶之一为γ分泌酶。DAPT作为Notch信号通路的阻断剂， 能够特异地阻断γ分泌酶的作用， 从而阻止Notch的活化[4]。由于我们所利用的DC未经LPS刺激， 几乎不表达Notch受体的配体[5]。因此， 我们可以先用DAPT处理， 使Notch信号通路不受Jagged1活化， 之后再将Jagged1加入到DAPT处理组中作为实验对照组。虽然许多证据表明Jagged1Notch信号通路能影响外周T细胞的分化， 但是其中的确切机制还有待进一步研究。为此， 本实验通过研究Jagged1/Fc对DC和T细胞共培养体系所分泌的细胞因子的影响， 探讨Jagged1和外周T细胞分化之间的关系。

　　TGFβ和IL10是在免疫抑制中起重要作用的细胞因子。其中， TGFβ是Foxp3+调节性T细胞发育所必需的， 而 IL10则可以诱导幼稚T细胞分化成为Foxp3-调节性T细胞（Tr1）。在Notch信号通路方面， TGFβ信号转导通过Smad3与Notch1的胞内段的直接作用， 实现两个信号通路之间的相互“对话”[6]， 而Notch1信号通路的激活则可以提高CD4+T细胞分泌IL10。然而， Jagged1/Fc对共培养的细胞的TGFβ1和IL10表达水平均无显著影响。结果表明， 可能是Notch1的其他配体而非Jagged1会影响IL10的表达。

　　IL4和IFNγ分别是Th1与Th3所分泌的最典型的细胞因子。IL4通过激活GATA3和STAT6使幼稚T细胞向Th3分化， 而IFNγ通过激活Tbet和STAT1促进Th1的分化[7]。然而， IL4和IFNγ均抑制Th17的分化。Amsen等证实在抗原提呈细胞过表达Jagged1促进IL4的分泌， 而抑制IFNγ的产生[5]。相反， Palaga等发现在表达Notch1反义基因的小鼠中， 外周T细胞分泌的IFNγ明显减少[8]。本实验中， Jagged1/Fc能同时促进DCT细胞共培养体系分泌IL4和IFNγ。因此， Notch的激活可能在Th1和Th3的分化上具有双向调节作用。

　　IL2主要来自于活化的CD4+T细胞， 是体内Th3分化所不可缺少的细胞因子[9]。然而， IL2能通过活化STAT5负向调控Th17的分化， 并且在缺陷IL2的小鼠中， IL17的表达量增加[10]。Jagged1/Fc促进DCT细胞共培养体系分泌IL2， 提示Jagged1可能影响Th3和Th17的发育。

　　TNFα是体内最重要的致炎症因子之一， 能够诱导IL6和IL1β的产生， 从而促进Th1和Th17的免疫反应[11]。有研究表明， TNFα能促进类风湿关节炎滑膜细胞中Notch1胞内段的核转位， 并且阻断Notch1信号通路也会使TNFα的表达量降低[12]。与此相一致， Jagged1/Fc能促进DCT细胞共培养体系分泌TNFα。

　　由于IL4和IL2表达量的增加对Th3的分化起正调控作用， 则可能不利于Th1和Th17的分化; 而IFNγ和TNFα分泌水平的提高会促进Th1的分化， 却对Th3的分化起到制约作用。可见， Th1、 Th3和Th173种细胞的分化存在相互制约的关系， 所以Jagged1可能在调控Th1、 Th3和Th17的免疫反应的平衡上具有一定的作用。