新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响

作者：聂新民*， 周建大， 黄竹英， 桂嵘， 李登清， 唐华

【摘要】 　　目的: 研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响。方法: 将pcDNA3.1(+)/ NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG2 细胞， Northern blot筛选出阳性克隆， 通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质， 筛选出差异表达的蛋白质点， 并进行质谱分析鉴定。结果: 鉴定出6种表达上调的蛋白质点， 包括锌指蛋白、 肿瘤坏死因子受体、 酪氨酸蛋白磷酸化受体等， 这些蛋白质涉及基因转录、 信号转导等肿瘤发生相关事件。结论: NOR1基因可能通过上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展。

【关键词】 NOR1基因 双向电泳 基质辅助激光解吸飞行时间质谱

　　硝基还原酶基因NOR1是课题组克隆的一个与亚硝胺类化合物致癌密切相关的新基因[1]， GenBank登录号为AF462348。人体多组织Northern blot表达分析显示NOR1基因在所检测的肝、 脑、 肾、 肺、 脾脏、 骨骼肌等12种正常组织中广泛表达， 且有2个转录本(1600 bp， 1200 bp)[2]。通过构建NOR1基因真核表达载体及NOR1基因转染HepG2肝癌细胞系， 发现NOR1基因转染可引起IL8的表达升高[3， 4]。为了深入研究NOR1基因功能， 本试验运用转基因技术构建过表达NOR1基因肝癌细胞系HepG2， 采用高通量的蛋白质组技术（双相电泳， 质谱）研究过表达NOR1肝癌细胞系HepG2后蛋白质表达谱的改变， 通过对差异蛋白点的鉴定与分析， 探讨NOR1基因在肝癌发生、 发展中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人肝癌细胞系HepG2细胞由中南大学湘雅三医院检验科保存; pcDNA3.1(+)载体为哺乳动物高效表达载体， 为Invitrogen公司的产品; pcDNA3.1(+)/NOR1载体由中南大学湘雅三医院检验科构建; 随机引物标记盒购自美国Promega公司; TRIzolTM试剂购自美国Gibcol/BRL公司; 蛋白质相对分子质量(Mr)标准购自中科院上海生物化学研究所; 同位素α32pdCTP、 α33pdATP， 购自北京福瑞公司; 引物由大连宝生物有限公司合成; 固相pH梯度干胶条（pH3～10， 18 cm）、 载体两性电解质（pH3～10）、 IPG缓冲液、 覆盖液（Drystrip cover Fluid）、 石蜡油、 银染试剂盒、 IPGphor电泳单元及双向电泳附件、 EPS 3500电源、 重泡胀附件和循环水浴箱等电聚焦系统、 IPGPhor电泳系统等购自Pharmacia公司; 丙烯酰胺（acrylamide）、 亚甲基双丙烯酰胺（Bis）为国产分析纯; 乙腈（ACN）为国产色谱纯; 其他试剂为国产分析纯试剂; 垂直平板电泳系统、 循环水浴箱购自BioRad公司; PDQUEST 2D胶分析系统购自BioRad 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2稳定表达系的建立 方法详见文献[3]。上游引物为5′ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT3′， 下游引物为5′TCT CAG CCC TCT TTC AAA AAC TTC TC3′; 为了进一步验证稳定细胞系的建立， 我们还使用Northern blot方法进行了验证， 方法见分子克隆操作。

　　1.2.2 蛋白抽提与定量 细胞培养至对数生长期， 弃出培养液， 用胰酶消化， PBS洗后约2×106细胞中加入50 μL裂解液（8 mol/L urea， 40 g/L CHAPS， 40 mmol/L Tris， 65 mmol/L DTT）， 液氮反复冻融后， 加20 μL RNase(20 g/L)在4℃放置15 min， 13000 r/min， 4℃离心30 min， 收集上清液， 样品存放-70℃。蛋白定量用BSA方法操作， 每次上样量为300 mg。

　　1.2.3 等电聚焦电泳及银染 采用IPGphor等电聚焦系统， 把干胶条置于胶条盒中放置在IPGphor电泳仪上水化（水化液组成为: 8 mol/L urea， 5 g/L CHAPS， 2.8 g/L DTT及痕量溴酚蓝） 15～18 h， 水化完毕按500V， 1000V各1 h， 8000V 5 h等电聚焦聚焦结束后， 取出胶条， 加入平衡液A（8 mol/L urea， 0.5 mol/L TrisHCl， 20 g/L SDS， 300 g/L甘油， 1 g/L DTT）振荡平衡15 min， 再换平衡液B(8 mol/L urea， 0.5 mol/L TrisHCl， 20 g/L SDS， 300 g/L甘油， 15 g/L碘乙酰胺)振荡平衡15 min， 取出胶条滤干。第二向SDSPAGE基本上按照Bjellguist的方法进行。采用分离胶浓度为15 g/L的不连续SDSPAGE垂直平板电泳。银染按银染试剂盒操作手册操作。

　　1.2.4 图像分析 通过PDQuest 2D分析软件系统， 分别比较4次重复结果图谱， 将HepG2和转染NOR1细胞的进行匹配分析， 获得NOR1基因转染所致的蛋白质差异表达变化， 将这些蛋白点在双向电泳凝胶图谱上标出。

　　1.2.5 蛋白质的原位酶解 蛋白质原位酶解按Fernandez[5]和Gharahdaghi[6]的方法进行。

　　1.2.6 MADLITOF肽质指纹图分析 在样品中加入10 μL 1 g/L TFA水溶液， 振荡， 使样品充分溶解， 再用美国Millipore公司的10 μL ZipTipTM C18器嘴脱盐。制备好的样品使用美国BRUKER公司的ProFlexTM III MADLITOF质谱仪进行分析。

　　2 结果

　　2.1 阳性克隆的鉴定 将挑选出来的单克隆细胞扩大培养， 抽提RNA进行RTPCR鉴定。共挑选出8个单克隆细胞， 用RTPCR鉴定， 其中有4个为阳性克隆。为了进一步确正其真实性， 对其进行Northern blot筛选分析， 结果见图1。

　　图1 Northern blot 筛选分析（略）

　　Fig 1 Result of Northern blot analysis

　　2.2 肝癌细胞与转染NOR1的肝癌细胞的双向电泳图谱 根据杂交结果选取1号克隆为实验细胞， 抽提HepG2和稳定表达NOR1基因的HepG2阳性细胞内总蛋白， 采用双向凝胶电泳分离细胞内蛋白质， 图象扫描后用Pdquest软件分析， 可以识别700个左右的蛋白质点。4次重复结果统计显示HepG2和pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2细胞二维图谱的蛋白质点分别为(700±19)、 (700±28)个， 通过IMAGEMASTER软件匹配分析后确立了10个受NOR1基因转染影响表达明显上调的差异表达蛋白质点， 通过质谱鉴定出其中6个差异点， 结果见图2。

　　图2 肝癌细胞与转染NOR1的肝癌细胞的双向电泳图谱（略）

　　Fig 2 2D of HepG2 and pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2 cell protein

　　A: 2D of pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2 cell protein; B: 2D of HepG2 cell protein.

　　2.3 质谱鉴定蛋白质 应用MALDITOFMS方法对10个差异点进行鉴定， 6个获得了比较可靠的结果。将获得的肽质量指纹与数据库的人类标准的肽质指纹匹配， 这些蛋白分别为: 肿瘤坏死因子受体蛋白超家族成员11（tumor necrosis factor receptor superfamily， member 11b）， 肝磷脂结合生长因子结合蛋白（heparinbinding growth factor binding protein）; 酪氨酸蛋白磷酸化受体B(protein tyrosine phosphatase， receptor type， B); 锌指蛋白（zinc finger protein 223）; 假设蛋白（hypothetical protein）， Haptoglobin precursor等。

　　3 讨论
　　
　　肝癌的发生发展涉及到多个基因， 这些基因在整个基因网发挥着重要的作用， 一个基因也可能通过多个基因、 多个途径来影响细胞的功能。研究表明， HepG2细胞在转染NOR1基因后， 蛋白质表达谱发生了改变， 我们鉴定出6个表达明显上调的蛋白点， 其中: 包括锌指结构蛋白， 锌指结构指的是在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域， 锌指蛋白结构域能通过其保守的组氨酸、 半胱氨酸残基介导DNA， RNA及蛋白蛋白相互作用。锌指蛋白功能非常广泛， 其功能主要包括DNA识别， RNA包装转录调控， 蛋白折叠和装配、 脂质结合， 并参与生长发育过程和恶性肿瘤的形成等[7， 8]。此外， NOR1基因还可引起肿瘤坏死因子受体超家族成员蛋白的表达增加， 肿瘤坏死因子受体通过免疫调节网络在肿瘤的发生、 血管生成以及肿瘤转移中起到信号通路连接作用[9]， 这也可能与NOR1基因参与肿瘤坏死因子的表达调控相关， 其具体机制和作用信号通路有待进一步深入研究。

参考文献

　　[1] 聂新民， 周 鸣， 唐 珂， 等. 一个与化学因素致鼻咽癌相关的硝基还原酶基因的克隆与鉴定[J]. 中国生物化学与分子生物学报， 2003， 19（4）: 423-428.

　　[2] Nie XM， Zhang BC， Li GY. Cloning， Expression and Mutation analysis of NOR1， a novel human gene downregulated in HNE1 nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2003， 129（7）: 410-414.

　　[3] 傅锦芳， 李登清， 聂新民， 等. NOR1基因对HepG2细胞白介素8水平的影响[J]. 临床检验杂志， 2006， 14（4）: 282-284.

　　[4] 傅锦芳， 李登清， 桂 嵘， 等. NOR1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响[J]. 中华检验医学杂志， 2005， 28(12): 1267-1269.

　　[5] Fernandez J， Gharahdaghi F， Mische SM. Routine identification of proteins from sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis　(SDSPAGE) gels or polyvinyl difluoride membranes using matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flightmass spectrometry (MALDITOFMS)[J]. Electrophoresis， 1998， 19(6): 1036-1045.

　　［6］ Gharahdaghi F， Weinberg CR， Meagher DA， et al. Mass spectrometric identification of proteins from silverstained polyacrylamide gel: a method for the removal of silver ions to enhance sensitivity[J]. Electrophoresis， 1999， 20(3): 601-605.

　　[7] Ladomery M， Dellaire G. Multifunctional zinc finger proteins in development and disease[J]. Ann Hum Genet， 2002， 66(6): 331-342.

　　[8] Laity JH， Lee BM， Wright PE. Zinc finger proteins: New insights into structural and functional persity[J]. Curr Opin Struct Biol， 2001， 11(1): 39-46.

　　[9] 郑雪平， 胡学强. GITR/GITRL系统在免疫调节中的作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23（4）: 385-387.