结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫效果观察

　　　　　　作者：高蕾， 鲍朗， 郝牧， 张会东

【摘要】 　　目的: 研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA（Ag85A和ESAT6）疫苗联合免疫， BCG免疫以及联合DNA疫苗初免—BCG加强免疫等不同的免疫策略， 诱导免疫应答效果观察。方法: 健康雌性BALB/c小鼠24只， 随机分成PBS 阴性对照组， DNA初免—BCG异源加强组， DNA（Ag85A和ESAT6）初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组， 共进行3次免疫， 初免2次， 最后1次加强， 间隔2周1次。PBS组3次均注射PBS 溶液; DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次， 最后1次以BCG加强免疫; DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫; BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫。末次免疫后4、 6、 8周分别分离血清测定总IgG水平， 同时分离小鼠脾细胞， 体外经TBPPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验（XTT法）并测定脾细胞培养上清中IFNγ和IL4水平。结果: DNA/BCG、 DNA/DNA、 BCG组体外经TBPPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生， 3组平均效价为1∶120、 1∶160、 1∶80， DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组; 小鼠脾细胞体外经TBPPD刺激后， 均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFNγ反应， 其中DNA/BCG组IFNγ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组（P&<0.05）。结论: 联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应， 产生高水平的IFNγ。

【关键词】 结核分枝杆菌 Ag85A ESAT 6 异源初免—加强免疫

　　[Abstract] AIM: To compare the immunogenicity of vaccine strategies about combined DNA primeBCG boost and DNA or BCG vaccination only. METHODS: BALB/c mice were pided into four groups each containing 6 mice， and all mice received three immunizations at 2 weeks interval. One group of mice was vaccinated with PBS (PBS group); one group was vaccinated twice at 0 week and 2 weeks with combined DNA expressing two mycobacterial antigens， ESAT6 and antigen 85A respectively; and then boosted with BCG at 4 weeks (DNA/BCG group); another group was vaccinated twice with combined DNA at 0 week， 2 weeks and 4 weeks(DNA/DNA group); and the final group received PBS twice at 0 week and 2 weeks and then vaccinated with BCG at 4 weeks(BCG group). Specific IgG antibody in serum of mice was determined with indirect ELISA in 4 weeks， 6 weeks， 8 weeks respectively after final vaccination.The splenic lymphocytes of mice were separated and stimulated with PPD to measure their proliferation by XTT， and to evaluate the production of interferonr(IFNγ) and IL4 in cell suspensions of spleen cells by ELISA. RESULTS: PPD could stimulate specific IgG responses in DNA/BCG， DNA/DNA and BCG groups (DNA/DNA group&>DNA/BCG group and BCG group)， and the most significant response occurred in 12 weeks; the splenic lymphocyte proliferation reactions and IFNγ and IL4 production was detectable in DNA/BCG， DNA/DNA and BCG groups and DNA/BCG group induced significant higher production， especially in 12 weeks. CONCLUSION: Priming with the combined DNA vaccines and boost with attenuated M. bovis vaccine (BCG) could enhance specific cell reactions and high level IFNγ compared with DNA or attenuated M. bovis vaccine alone.

　　[Keywords]Mycobacterium tuberculosis; Ag85A; ESAT6; heterologous primeboost strategy

　　自从1993年世界卫生组织（WHO）宣布全球进入结核紧急状态，结核病再度引起各国政府的广泛关注。尤其是近年来耐药结核分枝杆菌(MTB)的流行， MTB和HIV交叉感染， 更加剧了结核的发病率和死亡率。卡介苗（BCG）作为传统的抗结核疫苗， 其对成人的低保护作用和保护效率的不确定性， 迫使我们研究寻找更为合适的疫苗或者更有效的免疫方法。结核杆菌免疫保护性抗原基因的DNA疫苗是近年来研究较多的新型疫苗， 但大量实验证明， DNA免疫后诱导的特异性免疫应答强度不能满足预防性和治疗性疫苗的要求， 其所获得的抗结核杆菌攻击能力也低于BCG免疫的效果[1]。因此， 改善DNA疫苗免疫方式从而提高其抗结核感染的效果就显得尤为重要。本研究中使用结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A和ESAT6混合DNA疫苗进行初次免疫， 再加以BCG加强免疫， 对异源DNA初免—BCG加强免疫策略改善基因疫苗免疫效应的作用进行研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 近交系BALB/c小鼠(24只， 雌性， 6～8周龄)由本校实验动物中心提供。pcESAT6是以pcDNA3.1真核质粒为载体构建的表达型重组质粒， 由本实验室构建[2]。结核杆菌H37Rv株基因组DNA由本实验室保存。DNA85A真核表达质粒构建如下。结核杆菌卡介苗上海株（BCG）， 由成都生物制品研究所提供， 本室常规培养。结核患者阳性血清， 由四川大学华西附一院呼吸内科结核病房惠赠。Endofree Plasmid Mini Kit II质粒小量抽提试剂盒及高纯度质粒提取试剂盒购自Omega公司; TBPPD（1 mg/L）由北京祥瑞生物制品有限公司提供; RPMI1640和小牛血清购自成都哈里生物公司; 小鼠干扰素γ（IFNγ）和白介素4（IL4）细胞因子酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自Biosource公司。HRP标记的羊抗鼠IgG、 邻苯二胺（OPD）购自北京博瑞克公司， XTT是BBI公司产品。限制性内切酶购自晶美生物公司; Primer STAR高保真Taq DNA聚合酶、 DNA快速连接试剂盒、 胶回收及PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物公司。核酸分子量标准DL 2000及Marker IV购自成都博瑞克生物公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达质粒pcDNA3.1Ag85A的构建 （1）引物的设计及目的基因的PCR扩增: 根据GenBank中结核杆菌Ag85A抗原基因序列（GenBank登录号AY207395）设计上下游引物为: P1: 5′GTTGGATCCTAATGCAGCTTGTTGACAGGGTT3′， 含BamH I酶切位点， P2: 5′GATGAATTCCTAGGCGCCCTGGGGCGCGGGCA3′， 含EcoR I酶切位点。引物由上海Invitrogen公司合成并纯化。以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板进行PCR扩增， 扩增产物以7 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。（2）重组质粒的构建Ag85A PCR产物及pcDNA3.1质粒经DNA纯化试剂盒纯化后， 分别用BamH I和EcoR I双酶切并经胶回收纯化后， 按10∶1的摩尔比（PCR产物∶载体）采用宝生物（大连）公司快速连接试剂盒， 按说明书操作进行连接。筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定， 并命名为pcAg85A。序列测定由上海Invitrogen公司完成。

　　1.2.2 DNA疫苗的制备 按照Endofree Plasmid Mini Kit II质粒小量抽提试剂盒说明书大量抽提质粒pcAg85A和pcESAT6， 以紫外分光光度计（BioRad）测定A260/280比值并定量后， 用pH7.4的PBS调整密度为1 g/L备用。

　　1.2.3 BCG的准备 取在苏通氏培养基上生长良好的BCG 2周培养物， 称取湿质量为10 mg的菌体， 加入3 mL PBST溶液(含0.5 g/L Tween80)， 用乳钵研磨成均匀的菌悬液， -70℃保存备用。注射前冻融并充分混匀， 用生理盐水稀释成1 mg/3 mL的菌悬液， 于小鼠皮下注射0.3 mL/只， 相当于湿菌0.1 mg/只， 其中活菌量为106 CFU/mL[3]。

　　1.2.4 动物免疫 将24只小鼠随机分成4组: A: PBS对照组， B: DNA/BCG异源加强组， C: DNA/DNA同源加强组， D: BCG组， 每组6只小鼠。B， C组分别在0、 2周以混合质粒DNA初次免疫小鼠， 4周时B组以BCG， C组以混合质粒DNA加强免疫。A组小鼠在0、 2、 4周均注射PBS作为阴性对照， D组小鼠在0、 2周注射PBS， 4周时以BCG进行免疫。免疫方案（表1）。初次免疫时， 每只小鼠于胫前肌多部位注射7.5 g/L布比卡因和质粒DNA混合物（1∶4， 100 μL）， 含质粒pcAg85A 40 μg， 质粒pcESAT640 μg。加强免疫时， 于皮下注射BCG菌悬液0.3mL（相当于湿菌0.1mg/只， 其中含活菌量106CFU/mL）。

　　表1 动物实验免疫方案（略）

　　Tab 1 Immunization strategy of animal experiment

　　1.2.5 特异性抗体IgG的检测 分别于小鼠加强免疫后4、 6、 8周时摘除眼球取血， 分离血清后-20℃冻存备用。采用间接ELISA法进行测定， 以PPD（1 mg/L） 100 μL/孔包被酶标板4℃过夜; 加5 g/L脱脂奶粉封闭2 h， 洗板后， 依次加入不同稀释度的待测血清以及HRP标记的羊抗鼠IgG， DAB显色后于波长490 nm测定吸光度（A）值。同时以结核患者阳性血清作为阳性对照， 以PBS组小鼠血清作为阴性对照， A490值&>0.05， A实验组/A对照组≥2.0时， 判为阳性。将抗体滴度定义为: 实验组和阴性对照组A490比值≥ 2.0时为最大的血清稀释倍数。

　　1.2.6 脾淋巴细胞增殖实验 分别于加强免疫后4、 6、 8周断颈处死小鼠，无菌条件下取脾脏， 加入1×PBS进行研磨， 最后以含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为4×108/L， 活细胞数在90%以上， 200 μL/孔加入96孔细胞培养板。实验组每孔加入PPD（1 mg/L） 50 μL进行刺激， 同时设对照孔和调零孔， 其中对照孔不加PPD， 调零孔不加淋巴细胞， 于37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培养120 h后， 每孔加入XTT（5 g/L） 4 μL， VK3 2 μL(终浓度0.1 mmol/L)继续培养4 h后终止培养， 测定A450值， 结果用刺激指数（stimulation index， SI）表示。SI＝A实验值/A对照组。

　　1.2.7 干扰素γ（IFNγ）和白介素4（IL4）的诱生及含量的测定 用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640调整细胞密度为4×109/L， 活细胞数在90%以上， 200 μL/孔加入96孔细胞培养板。同时每孔加入PPD（1 mg/L） 50 μL进行刺激， 于37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培养72 h。以5000 r/min离心5 min， 取上清以250 μL/只分装， -20℃冻存备用。IFNγ和IL4检测采用ELISA法， 分别以IFNγ和IL4标准品绘制标准曲线， 计算待测样品中IFNγ和IL4含量。

　　1.2.8 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析处理， 计量资料组间比较应用方差分析及LSDt检验。

　　2 结果

　　2.1 Ag85A基因的PCR扩增 扩增产物经7 g/L琼脂糖凝胶电泳检测， 在约1000 bp处可见一特异性扩增条带， 位置与预期大小相符（图1）。

　　图1 Ag85A PCR扩增琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 1 Agarose gel electrophoresis identification of Ag85A PCR product

　　1: DNA marker; 2: Ag85A PCR product.

　　2.2 重组真核表达质粒DNAAg85A的鉴定

　　2.2.1 限制性内切酶酶切消化 DNAAg85A重组质粒经限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切后， 电泳后可见在位于1000 bp处出现特异性条带， 与Ag85A基因的大小相符（图2）。

　　图2 重组真核表达质粒DNAAg85A酶切鉴定图（略）

　　Fig 2 Restriction enzymes analysis of DNAAg85A

　　1: DNA marker; 2: DNAAg85A; 3: DNAAg85A digested with BamH I and EcoR I; 4: DNAAg85A cut by BamH I;　　5: pcDNA3.1; 6: Ag85A PCR product.

　　2.2.2 DNA序列分析鉴定 重组质粒测序报告显示， Ag85A基因序列经高保真Taq DNA 聚合酶（Primer STAR DNA Taq）扩增， 测序结果与GenBank中收录一致， 未发生突变。

　　2.3 脾淋巴细胞增殖实验 加强免疫后4、 6、 8周的小鼠脾细胞在体外经PPD刺激后， DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组小鼠脾淋巴细胞在3个时间段的增殖活性与同时间段PBS组比较均有统计学意义， 其SI值为PBS组的2倍以上(P&<0.05)。DNA/BCG组小鼠脾淋巴细胞的增殖高于DNA/DNA组和BCG组（P&<0.05）， DNA/DNA组和BCG组高于PBS（P&<0.05）。与加强免疫后4周相比， 加强免疫后6、 8周 DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈上升趋势， 并且在加强免疫后8周达到较高水平（图3）。

　　图3 PPD刺激产生的特异性淋巴细胞增殖反应（略）

　　Fig 3 Lymphocyte proliferation stimulated by PPD

　　2.4 特异性抗体IgG的检测 加强免疫后4、 6、 8周通过间接ELISA法检测小鼠血清中TBPPD特异性IgG水平。DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组与同时间段PBS组的比值均&>2， 呈阳性反应， DNA/DNA组与DNA/BCG组和BCG组相比， 抗体滴度较高。加强免疫后4、 6、 8周 DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组小鼠抗体滴度逐渐增高， 并且在加强免疫后8周达到较高水平。各组3个时间段的平均效价分别为1∶120、 1∶160、 1∶80。

　　2.5 IFNγ水平 四组小鼠脾淋巴细胞在加强免疫后4、 6、 8周体外经PPD刺激， 测定细胞上清中IFNγ含量发现， DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组脾淋巴细胞分泌产生的IFNγ与同时间段PBS组比较均有统计学意义（P&<0.01）， DNA/BCG组与DNA/DNA组和BCG组相比也有统计学意义（P&<0.05）。DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组分别在加强免疫后4、 6、 8周进行比较， IFNγ的分泌量逐渐增加， 并且在加强免疫后8周3组的IFNγ分泌均达到各组的高峰（表2）。

　　表2 小鼠脾淋巴细胞培养上清中PPD特异性IFNγ含量（略）

　　Tab 2 PPDspecific IFNγ level in culture supernatant of splenic lymphocytes of mice immunized by DNA vaccine

　　aP&<0.05 vs DNA/DNA and BCG group; bP&<0.01 vs PBS group; cP&<0.05 vs DNA/DNA group.

　　2.6 IL4水平 A、 B、 C、 D组小鼠脾细胞体外经PPD刺激后， 测定细胞上清中IL4的分泌， 发现IL4含量很低， 仅为纳克水平。与加强免疫后4周相比， 加强免疫后6、 8周DNA/BCG组， DNA/DNA组和BCG组IL4的分泌均有降低趋势， 差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　3 讨论
　　
　　“初免—加强”的免疫策略是目前研究较多的针对感染性疾病的有效的免疫方法之一， 通过使用相同或不同的疫苗来重复免疫接种， 以达到增强疫苗的免疫效果的作用。相对于传统的加强免疫（数次免疫使用同一种疫苗）而言， 初免与加强免疫使用不同的疫苗的方法称为异源初免—加强。
　　
　　针对结核分枝杆菌的异源初免加强的免疫策略通过不同传递系统的组合， 改善DNA疫苗的免疫效果， 获得持续的免疫原性， 并有效的刺激机体产生大量的IFNγ[4]。其免疫方式主要包括DNA/表达相同抗原的修饰型病毒载体初免—加强;DNA/蛋白初免—加强; DNA/BCG初免—加强等。采用异源初免—加强的免疫策略可以诱导特异的CD4+和CD8+T细胞反应， 目前已经在很多结核感染模型中取得了较为明显的成效[5-7]。另一方面， 采用鸡尾酒疫苗， 即混合几种不同DNA疫苗以改善DNA疫苗抗结核杆菌的能力也是目前研究较多且有效的免疫方法。混合DNA疫苗与单独使用一种疫苗相比， 可以增强细胞免疫[8]。故本实验联合2种DNA疫苗进行初免， 再以BCG加强免疫， 观察小鼠体内免疫效果的变化。ESAT6和Ag85A都是结核分枝杆菌的早期培养液分泌蛋白中具有较强免疫保护作用的抗原成分， 分别含有多个不同的T、 B细胞表位， 能诱导机体产生保护性细胞和体液免疫， 是研究最多的TB候选DNA疫苗。以这2种DNA疫苗混合作为初免成分， 能刺激机体在早期诱导特异性的CD4+T细胞反应， 产生高水平的IFNγ， 同时促使机体产生针对特异性T细胞的潜在的记忆， 当作为加强免疫的BCG进入机体后， 可以明显增强DNA疫苗诱导的特异性T细胞反应， 激活更强、 更广泛的CD4+和CD8+T细胞反应， 并诱导IL12、 IFN、 TNF等细胞因子的分泌[9]。
　　
　　研究结果表明， 采用ESAT6和Ag85A联合DNA疫苗初免—BCG加强免疫后， 可诱导较强的淋巴细胞增殖， 产生高水平的Th1型细胞因子IFNγ， 超过DNA同源加强组和BCG组， 但是诱发TBPPD特异性IgG抗体反应， DNA/BCG组虽高于BCG组， 但不如DNA/DNA组产生的抗体效价高。说明ESAT6和Ag85A联合DNA疫苗初免—BCG异源加强的免疫策略， 能够有效的激活小鼠体内的Th1型为主的免疫应答， 产生较强的免疫原性， 对于诱导Th3型反应及抗体的产生作用较DNA疫苗同源加强的方法弱。这一现象的产生， 可能是因为BCG中只含有编码Ag85A抗原的基因， 缺失ESAT6编码基因， 不能表达ESAT6的抗原蛋白， 诱导机体产生特异性抗体的能力受到限制。若采用含有高表达这2种保护抗原的基因重组卡介苗作加强免疫， 预计会获得较为理想的结果。IL4主要是一种Th3 型反应的指标， 在本实验中其含量低， 仅为纳克水平， 不具有统计学意义。
　　
　　我们的实验证明对小鼠使用联合DNA疫苗初免—BCG加强的异源初免—加强免疫策略， 能引起小鼠体内的特异性免疫应答， 并以Th1型为主。该方法对增强免疫原性的作用大于使用DNA同源加强和单独的BCG免疫， 但诱导特异性抗体的能力较低。
　　
　　异源初免—加强免疫策略已经成为结核疫苗研究的又一新趋势[10]， 其有效的提高机体免疫反应为临床开发针对结核杆菌疫苗的实施方案提供了一定的应用前景。

参考文献

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