作者：邵燕丽， 吕小华， 吕世静*， 黄罗佳， 何德， 陈文青
【摘要】 目的: 观察不同情况下结核性胸腔积液中3种致炎细胞因子IL-12、 IL-18、 TNF-α和2种抑制性细胞因子TGF-β1、 IL-10的变化。方法: 采用ABC-ELISA及双抗体夹心ELISA进行检测， 并进行相关性分析。 结果: 除IL-18外， IL-12、 TNF-α、 IL-10胸水中含量都远远超过血清中的含量， TGF-β1血清中含量远远超过胸水中含量(P&<0.05或P&<0.01)。 结论: IL-18可能用作加强疫苗保护性的一种辅助成分; 证明细胞因子IL-12、 TNF-α、 TGF-β1、 IL-10与结核病免疫发病密切相关。
【关键词】 胸腔积液/结核 细胞因子/致炎性 细胞因子/抑制性
结核病（tuberculosis， TB）是世界上引起死亡的最严重的感染性疾病， 结核分支杆菌（mycobacterium tuberculosis， Mtb）是结核病的病原。近年来， 由于耐药Mtb株的出现， 及爱滋病（AIDS）合并结核病正成为HIV阳性人群最主要的死亡原因， 对TB免疫发病机制的研究及发展新的治疗方法得到了日益广泛的重视。单核巨噬细胞在结核病的免疫过程中起着中心的作用， 不仅吞噬Mtb并控制其生长， 而且还分泌大量的细胞因子， 包括致炎细胞因子和抑制性细胞因子调节巨噬细胞功能和T细胞反应［1］。本研究中对结核性胸腔积液(pleural fluid， PF)中主要由单核巨噬细胞来源的3种致炎细胞因子IL-12、 IL-18、 TNF-α及2种抑制性细胞因子TGF-β1、 IL-10进行研究， 以加深对TB免疫发病机制的了解， 为发展新疫苗和开拓新疗法提供依据［2， 3］。
1 材料和方法
1.1 材料 收集2005-03/2006-04， 湛江市结核病防治所，结核性胸腔积液患者的胸水及入院时的血清标本共39例， 男31例， 年龄22～83岁， 女8例， 年龄18～62岁。已按结核病诊断标准确诊为结核病。根据患者入院情况分为初治组和复治组， 其分类标准按中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》。本研究中初治组患者29例， 复治组患者10例。按1998年全国结核病分类法研讨会制定的中国结核病分类法， 对患者进行分型。39例患者中， Ⅱ型（血行播散型肺结核）中急性粟粒性肺结核1例; Ⅲ型（继发型肺结核）28例; Ⅳ型（结核性胸膜炎）10例。human IL-12 total(p40+p70)、 human IL-18试剂盒购自奥地利 Bender MedSystems; 人TNF-α、 TGF-β1、 IL-10试剂盒均购自深圳晶美公司ELx800型酶标仪为美国Bio-Tek公司产品。
1.2 方法
1.2.1 胸水标本的采集 临床采集检者新鲜穿刺胸水约5 mL， 以3 000 r/min 离心15 min， 分装， -20℃保存。血清标本为入院时常规检查所抽全血标本， 分离血清， -20℃保存待用。
1.2.2 细胞因子的检测 细胞因子检测均按试剂盒说明书进行。进口试剂检测原理为ABC-ELISA， 是将标本或标准品加入预先包被相应抗体的微孔条， 再加入生物素标记的相应mAb， 孵育， 洗去未结合的标记抗体；加入抗生物素蛋白链菌素标记的辣根过氧化物酶(HRP)， 再孵育后， 洗去多余部分， 加入底物显色， 显色深浅与标本或标准品含量成正比。通过酶标仪检测的标准品吸光度绘制标准曲线， 进而根据样品的吸光度得出样品浓度。进口分装试剂检测为双抗体夹心ELISA，是将标本或标准品加入已包被相应抗体的微孔条中， 孵育后洗板; 然后加入生物素化的抗体和HRP标记的亲和素， 洗去多余成分后加入显色剂。根据酶标仪检测的标准品吸光度绘制标准曲线， 根据样品吸光度从标准曲线上查出样品含量。
1.2.3 统计学处理 用SAS软件进行。先对总体进行正态性检验， 若为正态总体， 其统计学描述为x±s， 组内比较用配对t检验; 若为非正态总体， 统计学描述为M±QR（中位数±四分位数间距）， 组内比较用Wilcoxon符号秩检验。用SAS程序中关于相关和回归分析的程序进行各细胞因子间相关性分析。
2 结果
2.1 初治组、复治组2类细胞因子水平及相关性分析
2.1.1 初治组、 复治组2类细胞因子水平 除IL-18外， 其他几种细胞因子血清与胸水中浓度都有显著或极显著差异(P&<0.05或P&<0.01); 初治组与复治组之间血清与胸水中几种细胞因子浓度均无统计学意义; 复治组TGF-β1胸水与血清中含量无统计学意义(表1)。
2.1.2 两组胸水中各细胞因子水平相关性分析 (1)初治组各细胞因子水平间相关性分析: IL-12与TGF-β1间呈正相关（r=0.3931）， IL-12与IL-10间呈正相关（r=0.5508）， IL-18与TGF-β1间呈正相关（r=0.4597）， TNF-α与IL-10间也呈正相关(r=0.6481)。(2)复治组各细胞因子水平间相关性分析: IL-12与TNF-α间呈正相关(r=0.8521)。(3)二组总体各细胞因子水平间相关性分析: 从二组总体来看， IL-12与TNF-α间呈正相关（r=0.3173 ）， IL-12与IL-10间呈正相关（r=0.4819）， IL-18与TGF-β1 间也呈正相关（r=0.3161）， TNF-α与IL-10间呈正相关（r=0.5670）。
表1 初治组、 复治组2类细胞因子水平（略）
aP&<0.05， bP&<0.01 vs PF.
2.2 不同临床类型结核患者2类细胞因子水平及相关性分析
2.2.1 不同临床类型结核患者2类细胞因子水平 Ⅲ、 Ⅳ型患者除IL-18外， 其他几种细胞因子胸水与血清中含量均有统计学意义; Ⅲ、 Ⅳ型间比较， 血清中TGF-β1与胸水中IL-10水平有统计学意义（表2）。
表2 不同临床类型结核患者2类细胞因子水平（略）
aP&<0.05， bP&<0.01 vs PF; cP&<0.05， dP&<0.01 vs Ⅲ.
2.2.2 Ⅲ型结核患者胸水中各细胞因子相关性分析 Ⅲ型患者胸水中IL-12与TNF-α呈正相关（r=0.4493 ）， IL-12与IL-10呈正相关（r=0.5880）， TNF-α与IL-10呈正相关（r= 0.4776）。
2.2.3 Ⅳ型结核患者胸水中各细胞因子相关性分析 Ⅳ型患者胸水中仅TNF-α与IL-10呈正相关（r=0.7603）。
2.3 Ⅲ、 Ⅳ型患者治疗好转过程中胸水中2类细胞因子水平动态观测 对治疗过程中X线胸片示进展期到好转期的10例Ⅲ型患者和5例Ⅳ型患者胸水中的5种细胞因子水平进行了观测。结果发现: Ⅲ型患者10例中8例IL-12水平升高， 2例降低; 7例IL-18升高2例不变， 1例降低; 5例TNF-α升高， 5例降低; 6例TGF-β1升高， 4例降低; 9例IL-10降低， 1例升高。Ⅳ型患者5例中2例IL-12升高， 3例降低; 3例IL-18升高， 2例降低; 4例TNF-α升高， 1例降低; 4例TGF-β1升高， 1例降低; 3例IL-10升高， 2例降低。
3 讨论
本研究中发现， 不管是初治组、复治组， Ⅲ型还是Ⅳ型患者， IL-12、 TNF-α、 IL-10胸水中的含量都远远超过血清中的含量， 血清中TGF-β1含量远远高于胸水中含量， 表明这四种细胞因子都参与了结核病的胸膜腔局部免疫; 而IL-18不管在初治组、 复治组， Ⅲ型还是Ⅳ型， 胸水中的含量与血清中的含量都无统计学意义， 可能与IL-18的作用是辅助IL-12诱导IFN-γ产生有关， 与Song 等［4］的研究结果相一致。目前研究用增加Th1型细胞因子浓度来提高疫苗的保护性， 如IL-12、 IL-18都用于作疫苗的佐剂［5， 6］（adjuvant）。本实验中发现， IL-18胸水与血清中含量没有显著性差异， 为范雄林等［6］的研究结果提供了一方面的依据。
本研究中对胸水中各种细胞因子间相关性分析结果与体外研究结果基本相符［7-10］。对Ⅲ型、 Ⅳ型结核患者这几种细胞因子在胸水中和在血清中水平的研究表明， 仅血清中TGF-β1及胸水中IL-10水平在这2型患者间有统计学意义， 胸水中IL-10水平在这Ⅱ型患者中差异极显著。从检测结果可见， 血清中TGF-β1水平远远高于胸水中水平， Ⅱ型患者血清中TGF-β1水平差异显著， 原因是结核性胸膜炎为结核杆菌本身及蛋白抗原渗出胸膜， 胸膜受刺激后引起的迟发型超敏反应， 其反应强度大、炎症严重， 而TGF-β1在结核性胸膜炎中对肉芽肿性炎症的消退和受损组织的胸膜纤维化中起着重要的作用， 所以表现更高水平的TGF-β1消耗来对抗感染引起的免疫。而胸水中IL-10水平在Ⅱ型间差异极显著， 是3型患者胸水中IL-10含量极显著高于Ⅳ型患者， 表明IL-10在Ⅲ型结核病抗感染免疫中更为重要， 与文献报道相符。复治组胸水和血清中TGF-β1水平无统计学意义， 可能为感染趋缓和。本研究虽然检测标本例数较少， 但结果仍有一定参考价值。
本研究中观测了10例Ⅲ型患者和5例Ⅳ型患者， 治疗过程中X线胸片示进展期至好转期， 其胸水中这2类细胞因子的水平及变化。结果表明， 用细胞因子来开展免疫疗法， 不能一概而论; 用何种细胞因子进行治疗， 是否会发挥保护效应， 还取决于体内的免疫环境， 要使用能取得满意效果的细胞因子， 才能达到免疫治疗的效果。
参考文献
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