密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

【摘要】 目的: 构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2。方法: 用PCR技术从988载体中获得L1IRESL2片段， 将该片段克隆到pCRXLTOPO载体， 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中， 从而构建真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2; 通过水动力转染技术(hydrodynamicsbased transfection)和脂质体细胞转染法(liposomemediated transfection of cells)， 检测衣壳基因的体内、 外转录情况; 重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化， 用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果: 酶切和测序结果表明真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、 293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE（cytopathic effect）现象， 表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达。结论: 成功地构建了pcDNA3.1L1IRESL2共表达真核载体， 为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。

【关键词】 密码子优化 衣壳基因 共表达真核载体 细胞转染

　人乳头瘤病毒(human papillomavirus， HPV)属乳多空病毒科， 具有上皮细胞嗜性。迄今为止， 已分离到的基因型有100种以上［1， 2］。根据各型病毒的潜在致病性可将HPV分为低危型和高危型两类， 大量研究证实高危型中的16、 18型与宫颈癌的发生密切相关， 其中又以HPV16型最为常见。宫颈癌是全世界仅次于乳腺癌致妇女死亡的第二大癌症， 据报道全球每年大约有50万宫颈癌新发病例， 约25万人死于该癌症［3］。因为乳头瘤病毒的增殖与上皮细胞的分化紧密相连， 所以一直以来感染性乳头瘤病毒只能通过烦琐的器官培养（organotypic cultures）和小鼠异种移植（mouse xenografts）途径获得， 而用这两种方法很难获得足量的野生型或突变型HPV颗粒， 这大大限制了乳头瘤病毒生物学许多方面的研究［4-6］。最近Pyeon［7］、 Culp［8］采用假病毒技术建立了用于病毒培养的瞬时转染系统， 该系统中每个细胞能产生大量有感染性的病毒， 病毒产生量是常规器官培养的1000倍之多。Pyeon的研究表明， 该瞬时转染系统要求密码子优化的L1与L2基因必须同时转染细胞， 而单独L1基因或L2基因都不会使该系统发挥作用。Pyeon采用的是pcDNAHPV16L1和pcDNAHPV16L2两种质粒进行共转染， 而本研究中， 我们构建的是密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体即pcDNA3.1L1IRESL2， 通过连接子IRES实现了L1和L2基因在一个载体中的共表达， 无需同时转染两个质粒， 可大大简化实验操作。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 988质粒（德国科学家Martin Mueller惠赠）， pcDNA3.1(+)载体（本实验室库存）; 细胞株: 293T细胞（中国农业科学院哈尔滨兽研所惠赠）; LA Taq DNA聚合酶和反转录试剂盒（购自fermentas公司）; 质粒提取和胶回收试剂盒（购自AXYGEN公司）; TOPOXL PCR克隆试剂盒及LipofecamineTM2000（购自Invitrogen公司）; 电转化感受态Top10菌（购自TaKaRa公司）; HPV16 L1单克隆抗体(mAb)（购自上海吉泰新择生物科技有限公司）; 辣根过氧化物(HRP)标记的羊抗鼠IgG（购自北京博奥森生物技术有限公司）; 其他试剂均为国产分析纯; 昆明白雌性小鼠（6～8周龄， 质量18～22 g）购自新疆医科大学动物实验中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 根据pcDNA3.1(+)载体和德国科学家Martin Mueller提供的密码子优化的HPV16 L1、 L2基因序列设计5条引物， 具体序列见表1。

　　表1 引物设计（略）

　　Tab 1 Primer design

　　1.2.2 密码子优化的pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒的构建 构建策略: 以988质粒为模板扩增L1IRESL2基因片段， 将该片段构建到pCRXLTOPO载体上， 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。目的基因的获取: 以988质粒为模板， 以HPVHL1L2P1/HPVHL1L2P2为引物， 在LA DNA聚合酶作用下， 94℃预变性5 min， 94℃变性45 s， 67℃退火45 s， 68℃延伸4.5 min， 共30个循环， 68℃延伸30 min， 合成L1IRESL2基因。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。pCRXLTOPOL1IRESL2的构建: 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物， 切胶回收并纯化L1IRESL2片段。按照TOPOXL PCR克隆试剂盒说明书， 构建pCRXLTOPOL1IRESL2。电泳检测EcoR I、 Xho I 和Sfi I酶切产物。pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒的构建与鉴定: 用EcoR I、 Xho I和Sfi I酶切pCRXLTOPOL1IRESL2质粒， 回收纯化L1IRESL2片段。T4 DNA连接酶连接L1IRESL2基因片段与双酶切后的pcDNA3.1载体， 16℃过夜。用电转化法转化感受态Top10菌株（电压2500 V， 电阻200 Ω， 电容25 μF）， 37℃摇床孵育1 h后涂布含氨苄青霉素的LB选择平板， 37℃过夜。次日随机挑取阳性菌落， 碱裂解法小量提取质粒。EcoR I及Xho I双酶切， 琼脂糖电泳鉴定正确后送往上海生工测序。

　　1.2.3 小鼠肝脏中pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测 将等量的空pCDNA3.1载体和pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒（均为10 μg）分别溶于2.5 mL灭菌生理盐水中。采用以流体力学为基础的大容量快速尾静脉注射法（hydrodynamicsbased transfection method， HD)在7 s内注入小鼠尾静脉中［9， 10］。每组2只小鼠， 注射后8 h处死， 取肝脏， 按照Invitrogen trizol说明书提取总RNA， 按照fermentas公司反转录试剂盒要求合成cDNA。利用L1基因、 L2基因特异性引物检测这两种基因在小鼠肝脏中的表达情况。

　　1.2.4 293T细胞中pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测 选取对数生长期的293T细胞进行转染实验，转染步骤按Invitrogen公司提供的293T转染细胞的实验流程操作。空pCDNA3.1载体作为对照组， pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒为实验组。培养48 h后， 观察细胞形态变化并按照步骤1.2.3的方法提取RNA， 检测L1基因、 L2基因的表达情况。同时用TRIzol法提取细胞总蛋白， Western blot进行检测， 一抗为L1 mAb， 二抗为山羊抗小鼠HRP。

　　2 结果

　　2.1 目的基因的克隆 对PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 在约3600 bp处出现清晰的条带(图1)。与预计目的片段大小(3625 bp)相符。

　　图1 L1IRESL2 PCR琼脂糖凝胶电泳结果（略）

　　Fig 1 Agrose gel electrophoresis assay for PCR result of L1IRESL2 fragment

　　M: DL 15000+2000 marker; 1: PCR fragment of L1IRESL2.

　　2.2 pCRXLTOPOL1IRESL2的构建 用限制性内切酶EcoR I、 Xho I和Sfi I酶切pCRXLTOPOL1IRESL2， 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明pCRXLTOPOL1IRESL2构建成功（图2）。

　　图2 pCRXLTOPOL1IRESL2质粒酶切鉴定（略）

　　Fig 2 pCRXLTOPOL1IRESL2 plasmid identified by restriction enzyme digestion

　　M: DL 15000+2000 marker; 1: pCRXLTOPO vector; 2: pCRXLTOPOL1IRESL2 plasmid digested by EcoR I， Xho I and Sfi I.

　　2.3 pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒构建与鉴定 通过EcoR I、 Xho I和Sfi I酶切pCRXLTOPOL1IRESL2获得L1IRESL2基因片段， 定向亚克隆至经EcoR I和Xho I双酶切的pcDNA3.1载体中， 构建得到pcDNA3.1L1IRESL2重组载体。用EcoR I和Xho I双酶切鉴定并测序， 结果证实pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒构建正确:目的基因序列没有发生变异且插入方向正确（图3）。

　　图3 pcDNA3.1L1IRESL2质粒酶切鉴定（略）

　　Fig 3 Identification of pcDNA3.1L1IRESL2 plasmid by restriction enzyme digestion

　　M: DL 15000+2000 marker; 1: pcDNA3.1 vector; 2: pcDNA3.1L1IRESL2 plasmid digested by EcoR I and Xho I.

　　2.4 重组质粒在小鼠肝脏中的瞬时表达 RTPCR结果表明， 尾静脉注射pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒后， 密码子优化的HPV 16 L1、 L2基因均在小鼠肝脏中表达， 尾静脉注射pcDNA3.1（+）空质粒的小鼠肝脏中则未检测到有L1、 L2基因表达（图4、 5）。
2.5 转染后293T细胞的形态观察及pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测
2.5.1 形态观察 倒置显微镜观察发现实验组细胞与对照组细胞在形态学上发生明显变化， 对照组细胞的触角正常， 贴壁能力较好; 而实验组细胞明显变圆， 形态类似葡萄呈串状排列， 贴壁能力下降， 部分悬浮（图6）。

　　图4 注射pcDNA3.1L1IRESL2质粒后小鼠肝脏中L1基因的表达检测（略）

　　Fig 4 Results of L1 gene expressed in mouse liver after pcDNA3.1L1IRESL2 injection

　　M: DL 2000 marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3: RNA of pcDNA3.1vetor; 4: cDNA of pcDNA3.1vetor; 5: RNA of pcDNA3.1HumanL1L2; 6: cDNAof pcDNA3.1HumanL1L2.

　　图5 注射pcDNA3.1L1IRESL2质粒后小鼠肝脏中L2基因的表达检测（略）

　　Fig 5 Results of L2 gene expressed in liver after pcDNA3.1L1IRESL2 injection

　　M: DL 2000 marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3: RNA of pcDNA3.1vetor; 4: cDNA of pcDNA3.1vetor; 5: RNA of pcDNA3.1HumanL1L2; 6: cDNAof pcDNA3.1HumanL1L2.

　　图6 pcDNA3.1L1IRESL2转染293T细胞后48 h细胞状态（略）

　　Fig 6 Images of 293T cells 48 hours after transfected pcDNA3.1L1IRESL2(×200)

　　A: pcDNA3.1; B: pcDNA3.1L1IRESL2.

　　2.5.2 重组质粒转录情况的检测 RTPCR结果表明， pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒转染293T细胞后， 密码子优化的HPV 16 L1、 L2基因均在293T细胞中转录表达， 而pcDNA3.1(+)空质粒未检测到L1、 L2基因转录(图7、 8)。

　　2.5.3 重组质粒蛋白的检测 用TRIzol提取细胞总蛋白后， 通过Western blot检测重组质粒中L1基因的表达情况， 印迹中只有实验组出现Mr 55000的条带， 与预计大小相符（图9）。

　　图7 pcDNA3.1L1IRESL2转染293T细胞后48 h L1基因转录检测（略）

　　Fig 7 Results of L1 transcription in the transfected 293T cells with pcDNA3.1L1IRESL2 after 48 h

　　M: DL 2000 marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3: cDNA of pcDNA3.1vetor; 4: RNA of pcDNA3.1HumanL1L2; 5: cDNAof pcDNA3.1HumanL1L2.

　　图8 pcDNA3.1L1IRESL2转染293T细胞后48h L2基因转录检测（略）

　　Fig 8 Results of L2 transcription in the transfected 293T cells with pcDNA3.1L1IRESL2 after 48 h

　　M: DL 2000 marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3: cDNA of pcDNA3.1vector; 4: RNA of pcDNA3.1HumanL1L2; 5: cDNAof pcDNA3.1HumanL1L2.

　　图9 pcDNA3.1L1IRESL2转染293T细胞后48h L1蛋白表达检测（略）

　　Fig 9 Western blot for expression of L1 protein in the transfected 293T cells with pcDNA3.1L1IRESL2 after 48 h

　　M: Protein marker; 1: 293T cells transfected with pcDNA3.1L1IRESL2; 2: 293T cells transfected with pcDNA3.1(+) vector; 3: 293T cells.

　　3 讨论
　　
　　宫颈癌在世界范围内成为导致妇女死亡的第二大恶性肿瘤。野生型病毒衣壳基因在真核细胞中表达水平极低， 这极大限制了HPV生物学方面的研究， 比如病毒复制与宿主的关系、 疫苗与药物的开发［3， 4］。众多研究者为了提高衣壳基因在真核细胞中的表达量进行了大量的探索性研究， 其中Leder成功合成了高表达的密码子优化的衣壳基因［11］。同义密码子的偏好性在生物界中普遍存在， 对基因表达有显著影响［12］。我们所构建的pcDNA3.1L1IRESL2载体中， 衣壳基因的密码子优化是根据人的密码子偏好性进行的， 这大大增强了衣壳基因在人细胞中的表达能力， 为获得大量的乳头瘤病毒样颗粒奠定基础。另外， pcDNA3.1(+)载体由于含有抗G418的抗性基因（即新霉素抗性基因， NeoR）， 所以可以用G418筛选出成功转染pcDNA3.1L1IRESL2的稳定细胞株， 这是Leder构建的988重组质粒所不具备的。
　　
　　Pyeon等研究发现， 单单L1或L2基因都不能使培养病毒的瞬时转染系统发挥作用。而本研究利用IRES(细胞内部核糖体进入位点)将L1和L2基因克隆到同一个载体中， 从而构建出密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体。IRES是mRNA5′端编码区的一段特殊序列， 它允许核糖体不从mRNA的5′到3′端阅读而直接在此序列处结合mRNA并起始翻译。通过IRES可将多个非相关基因连接在一起同时转录成一条单链mRNA， 但翻译相互独立而互不干扰， 这样就保证了用IRES序列连接的非相关基因可独立表达［13］。pcDNA3.1L1IRESL2同时表达L1、 L2两个衣壳基因， 该质粒与HPV基因组共转染293T细胞即可获得有感染性的病毒颗粒， 无需用多个质粒共转染， 简化了实验操作， 更方便于HPV生物学特性的研究。
　　
　　我们分别采用脂质体细胞转染法和水动力转染技术（尾静脉注射）转染pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒， RTPCR检测结果显示L1基因、 L2基因在293T细胞和小鼠肝脏内均得到表达; Western blot进一步证实L1基因可在293T细胞中表达。重组质粒转染293T细胞后出现CPE（cytopathic effect）现象， 表明衣壳基因在细胞中已表达。上述结果表明pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒构建成功， 为HPV16感染机制的进一步研究奠定基础。

　　致谢: 本研究在撰写过程中得到河南师范大学生命科学学院－省部共建细胞分化调控重点实验室陈晓光博士及新疆大学生命科学与技术学院庄淑珍博士后、 涂亦娴博士的指导， 在此深表感谢！

参考文献

　　［1］ Clifford GM， Smith JS， Plummer M， et al. Human papillomavirus types in invasive eervical cancer worldwide:a metaanalysis［J］. Br J Cancer， 2003， 88 (1): 63-73.

　　［2］ Steben M， DuarteFranco E. Human papillomavirus infection: Epidemiology and pathophysiology［J］. Gynecol Oncol， 2007， 107(Suppl2): S2-5.

　　［3］ Newall AT， Beutels P， Wood JG， et al. Costeffectiveness analyses of human papillomavirus vaccination［J］. Lancet Infect Dis， 2007， 7(4): 289-296.

　　［4］ Dollard SC， Wilson JL， Demeter LM， et al. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures［J］. Genes Dev， 1992， 6(7): 1131-1142.

　　［5］ Meyers C， Frattini MG， Hudson JB， et al. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation［J］. Science， 1992， 257(5072): 971-973.

　　［6］ McLaughlinDrubin ME， Christensen ND， Meyers C. Propagation， infection， and neutralization of authentic HPV16 virus［J］. Virology， 2004， 322(2): 213-219.

　　［7］ Pyeon D， Lambert PF， Ahlquist P. Production of infectious human papillomavirus independently of viral replication and epithelial cell differentiation［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102(26): 9311-9316.

　　［8］ Culp TD， Cladel NM， Balogh KK， et al. Papillomavirus particles assembled in 293TT cells are infectious in vivo［J］. J Virol， 2006， 80(22): 11381-11384.

　　［9］ Liu F， Song YK， Liu D. Hydrodynamicsbased transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA［J］. Gene Ther， 1999， 6(7): 1258-1266.

　　［10］ Kobayashi N， Hirata K， Chen S， et al. Hepatic delivery of particulates in the submicron range by a hydrodynamics based procedure: Implications for particulate gene delivery systems［J］. J Gene Med， 2004， 6(4): 455-463.

　　［11］ Leder C， Kleinschmidt JA， Wiethe C， et al. Enhancement of capsid gene expression: Preparing the human papillomavirus type 16 major structural gene L1 for DNA vaccination purposes［J］. J Virol， 2001， 75(19): 9201-9209.

　　［12］ Shpaer EG. Constraints on coden context in Escherichia coli genes. Their possible role in modulating the efficiency of translation［J］. J Mol Biol， 1986， 188(4): 555-564.

　　［13］ Malecki M， Przybyszewska M， Janik P. Construction of a bicistronic proangiogenic expression vector and its application in experimental angiogenesis in vivo［J］. Acta Biochim Pol， 2003， 50(3): 875-882