作者：尹晓光， 吴秀丽， 万敏， 张培因， 王艳媚， 王丽颖， 于永利
【摘要】 目的: 对制备的5株抗BCG Hsp65单克隆抗体（Hsp65 mAb）做进一步鉴定和应用。方法: 采用ELISA方法对mAb的效价、 亚类和结合抗原表位特性进行鉴定， 应用mAb对Hsp65融合蛋白进行了Western blot和免疫荧光检测。结果: 5株mAb的类型均为IgG， 其中ⅠC1和ⅡC3株mAb为IgG1亚类， ⅠA5、 ⅠC3和ⅠD6株mAb为IgG2a亚类。 抗原表位竞争结合分析显示， 在配对的不同亚类mAb中， 存在着结合Hsp65表面不同抗原表位的mAb。通过Western blot检测证实， Hsp65 mAb对Hsp65-MUC1检测结果， 与MUC1 mAb的一致。细胞免疫荧光检测显示， 制备的 mAb能够识别通过蛋白装载进入树突状细胞内的Hsp65-PSA。结论: 获得的Hsp65 mAb可做为检测工具， 用于研究BCG Hsp65及其融合蛋白的功能和表达。
【关键词】 BCG 热休克蛋白 单克隆抗体
来自分枝杆菌BCG的Mr 65000热休克蛋白（Hsp65）具有交叉提呈外源性抗原肽的功能， 已经引起免疫学家的高度重视［1］， 一些用于治疗肿瘤和病毒性疾病的Hsp65融合蛋白类疫苗已被研制［2， 3］。为研究此类疫苗的作用机制和纯化工艺， 我们先前利用Hsp65融合蛋白制备了5株Hsp65单克隆抗体（mAb）［4］， 本实验中我们对上述mAb做进一步鉴定， 并初步应用制备的mAb对Hsp65融合蛋白进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料 Hsp65、 Hsp65-MUC1、 Hsp65-PSA和Hsp65-GFP蛋白及分泌Hsp65 mAb的5株杂交瘤细胞由吉林大学基础医学院分子生物学教研室制备; HRP-羊抗鼠IgG、 HRP-羊抗鼠IgG1和HRP-羊抗鼠IgG2a及重组人的白介素4（rhIL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）购自BD公司; CY3-羊抗鼠IgG和MUC1 mAb购自Sigma公司; 淋巴细胞分离液为TBD公司产品; 胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司; 来自健康人外周血的浓缩白细胞由长春中心血站提供。
1.2 方法
1.2.1 mAb效价和亚类检测 将杂交瘤细胞进行培养并制备腹水， 用完全培养液（medium）对各株杂交瘤细胞的培养上清或腹水做10倍倍比稀释。在抗体效价检测时， 以包被酶标条的Hsp65蛋白为检测抗原， 系列稀释的培养上清和腹水为检测样品， medium为阴性对照， HRP-羊抗小鼠IgG为示踪抗体， 用常规ELISA方法检测［4］。在抗体亚类检测时， 以杂交瘤细胞培养上清做为检测样品， HRP-羊抗小鼠IgG1或HRP-羊抗小鼠IgG2a为示踪抗体， 其他同抗体效价检测过程。
1.2.2 mAb识别抗原表位分析 检测过程参照传统ELISA方法［5］， 并进行了改动。根据上述的mAb亚类检测结果， 在IgG1和IgG2a亚类mAb之间进行抗体配对。将配对的mAb先后与相同的Hsp65抗原反应， 通过检测后一种亚类mAb结合到固相抗原上的量， 判断配对mAb间是否存在抗原表位竞争结合作用。具体过程如下: 在包被Hsp65重组蛋白的酶标条中， 先加入0.1 mL IgG2a亚类mAb（做为抑制抗体）或0.1 mL medium（做为阴性对照）， 每种样品设3复孔。经过温浴反应和适当冲洗， 每孔均加入0.1 mL IgG1亚类mAb（做为结合抗体）。经过温浴和冲洗， 加入0.1 mL HRP-羊抗小鼠IgG1（做为示踪抗体）。酶标条用DAB底物显色后， 在492nm波长下检测样品的光密度值（A492）， 结果用SPSS软件统计分析。依据各mAb组与medium阴性对照组之间的A492值是否存在明显差异， 判断IgG2a亚类mAb与配对的IgG1亚类mAb之间， 结合到Hsp65抗原上位点的空间位置关系。
1.2.3 Western blot检测 对不同条件诱导表达的Hsp65-MUC1菌体裂解蛋白和纯化蛋白， 经SDS-PAGE电泳分离后， 进行蛋白染色和转膜。应用Hsp65 mAb和MUC1 mAb， 对各自的蛋白转移膜进行Western blot检测， 将Hsp65-MUC1的化学发光结果与考马斯亮蓝染色结果进行比较。
1.2.4 树突状细胞（DC）的分离、 培养和装载蛋白 来自健康献血者的浓缩白细胞， 通过淋巴细胞分离液、 密度梯度离心和聚苯乙烯培养板黏附过程， 分离出人外周血中的单核细胞［6］。将细胞按1×109/L的浓度接种12孔培养板（完全培养液为含100 mL/L牛血清的IMDM， 条件培养液为含5×105 IU/L rhIL-4和rhGM-CSF的完全培养液）， 用条件培养液诱导培养的单核细胞转化成DC。当培养到第5天时， 用完全培养液稀释DC至1×1010/L浓度， 取20 μL DC悬液， 滴加在1×1 cm的玻璃盖玻片上， 并在培养箱内培养1 h， 用于制备DC爬片。 经过适当冲洗后， 获得的DC爬片被分成2组， 各自装载Hsp65-PSA和Hsp65-GFP蛋白。装载的蛋白浓度为1 g/L， 装载的时间为0.5 h， 装载的过程在37℃、 50 mL/L CO2培养箱内完成。
1.2.5 细胞免疫荧光检测 经PBS冲洗后， 装载Hsp65-GFP的DC直接在激光共聚焦显微镜(Olympus FV500)下观察。装载Hsp65-PSA的DC， 经过40 g/L多聚甲醛固定、 5 mL/L Triton X-100透化处理和100 mL/L牛血清PBS封闭后， 用ⅠA5株Hsp65 mAb及CY3-羊抗鼠IgG进行细胞免疫荧光染色， 染色结果在激光共聚焦显微镜下观察。
2 结果
2.1 mAb效价和亚类检测 ELISA检测结果显示: 培养上清中的抗体效价均为1×103， 腹水中的抗体效价在1×106～1×108之间。5株细胞分泌的抗体均为IgG类抗体， 其中ⅠC1和ⅡC3细胞株分泌的抗体为IgG1亚类， ⅠA5、 ⅠD6和ⅠC3为IgG2a。
2.2 mAb识别Hsp65表位分析 为了分析制备的mAb结合在Hsp65抗原上的表位， 在空间位置上的相互关系， 我们应用间接ELISA， 对ⅠA5、 ⅠD6和ⅠC3株与ⅠC1和ⅡC3株之间配对mAb， 进行了抗原表位竞争结合分析， SPSS统计结果（图1）， ⅠC3与ⅠC1或ⅡC3之间存在抗原表位竞争结合抑制作用（aP&<0.01， bP&<0.05 vs medium组相比）， 但ⅠA5和ⅠD6与ⅠC1和ⅡC3之间无竞争抑制作用， 说明ⅠC1与ⅠA5或ⅠD6、 ⅡC3与ⅠA5或ⅠD6株配对抗体， 是结合在空间位置较远的不同抗原表位上， 它们在检测Hsp65融合蛋白时可匹配使用。
图1 抗体识别Hsp65表位分析（略）
aP&<0.01， bP&<0.05 vs medium组.
2.3 Western blot检测Hsp65-MUC1 研究制备的Hsp65 mAb在蛋白疫苗纯化工艺中的应用价值， 用含ⅠA5株Hsp65 mAb的培养上清， 对 Hsp65-MUC1表达菌的菌体裂解蛋白和纯化蛋白进行Western blot检测， 同时用MUC1 mAb做对照检测抗体。结果（图2）， 菌体裂解蛋白中的主要表达蛋白（2～5泳道）与纯化蛋白（1泳道）的Mr均为80000左右， 在不同诱导条件下， 工程菌表达目的蛋白的量有所不同（A）。Hsp65 mAb介导的Western blot检测结果（B）， 与MUC1 mAb的检测结果基本一致， 但MUC1 mAb可检测到一些降解带（C）。
图2 Hsp65-MUC1的检测（略）
A: SDS-PAGE检测; B: Hsp65 mAb介导的Western blot检测; C: MUC1 mAb介导的Western blot检测; M: 蛋白marker; 1: 纯化蛋白; 2-5: 菌体裂解蛋白.
2.4 免疫荧光检测DC装载的Hsp65-PSA 经Hsp65 mAb和CY3-羊抗鼠IgG间接免疫染色， 装载Hsp65-PSA的DC在激光共聚焦显微镜下观察结果（图3）， 在细胞质内， 充满被CY3红色荧光示踪的不均匀颗粒和团块状聚集的Hsp65-PSA蛋白， 细胞核未见染色（A）。DIC图像显示， DC贴壁生长， 形态正常， 可见细胞核（B）。为证实Hsp65 mAb对装载Hsp65-PSA的DC免疫检测结果的准确性， 我们同期用DC装载了Hsp65-GFP做为对比， 根据GFP的示踪， 判断Hsp65融合蛋白通过装载进入DC后的聚集位置， 结果在激光共聚焦显微镜下观察显示在装载Hsp65-GFP的DC胞质内， 存在颗粒和团块状的绿色荧光物（C）， 其分布特点与Hsp65-PSA免疫荧光染色结果基本一致。说明我们利用制备的Hsp65 mAb， 检测细胞内的Hsp65融合蛋白的结果是灵敏和可靠的。
图3 装载不同蛋白DC的显微镜图像（×600）（略）
A: 装载Hsp65-PSA蛋白DC的CY3荧光图像; B: A图中DC的DIC图像; C: 装载Hsp65-GFP蛋白DC的GFP荧光图像.
3 讨论
在Hsp65及其融合蛋白功能研究中， mAb是个有用的检测工具， 我们先前利用不同的Hsp65重组蛋白制备了Hsp65 mAb， 并对5株杂交瘤的特性进行了鉴定， 本实验中对制备的mAb做进一步应用研究。
Hsp65具有的分子伴侣功能和刺激细胞分泌细胞因子的能力， 与其寡聚体和多聚体形成的特殊空间结构密切相关， 对Hsp65蛋白晶体结构研究显示， 其空间构象是由氨基酸主链和侧链电荷相互作用， 以及氢键、 疏水键和范得华力等共同维系着［7］。当Hsp65的C末端偶联不同的外源性抗原时， 其空间结构可能发生改变。我们在制备杂交瘤时， 尽管采用了不同Hsp65融合蛋白进行动物免疫、 杂交瘤筛选和抗体鉴定， 也有必要对抗体结合抗原的表位做进一步研究。基于抗体亚类和效价检测基础上， 我们设计不同亚类抗体间竞争结合抗原表位的酶联免疫检测实验， 结果证明制备的IgG1与IgG2a亚类mAb之间， 存在结合相同和相近， 及不同抗原表位的配对抗体， 说明Hsp65分子表面存在着多个主要免疫显性表位， 这同文献报道的Hsp65存在的主要免疫显性表位的观点相一致［8］。抗体的应用价值需要在实际工作中进行检验。我们用制备的Hsp65 mAb与进口的MUC1 mAb做了对比检测， 显示2种mAb对结构完整的融合蛋白分子的检测结果是一致的， 不同的是MUC1 mAb能够检测出蛋白杂交带， 这可能与Hsp65-MUC1重组蛋白中的MUC1的串联重复表位的构建有关， 只要我们在应用Hsp65抗体时， 对获得的各株mAb进行合理的匹配使用， 可以进一步提高检测的灵敏度。上述Western blot检测结果也说明了， 制备的Hsp65 mAb能够识别变性的蛋白， 提示我们制备的抗体所识别的抗原表位是线性的。BCG Hsp65与人的HSP具有同源性， 在研究Hsp65融合蛋白的抗肿瘤和抗病毒作用机制过程中， 常在人细胞内进行Hsp65融合蛋白的示踪研究， 有必要对制备的mAb检测Hsp65蛋白的特异性进行鉴定。利用人DC的表面具有Hsp65受体和通过其受体介导Hsp65融合蛋白内化的特性， 我们对人外周血中的单核细胞进行了诱导， 用获得的DC装载了Hsp65-PSA， 并用Hsp65 mAb对装载Hsp65-PSA的DC进行了免疫荧光染色， 同时用Hsp65-GPF装载了DC做为实验对照， 结果证实了mAb是特异性针对BCG Hsp65。制备的mAb是否存在对其他哺乳动物细胞和微生物的交叉反应需今后进一步证明。
总之， 我们获得了针对不同抗原表位的2种亚类抗体， 这些抗体的制备将有助于建立灵敏和特异性检测试剂， 用来研究Hsp65及其融合蛋白的功能或融合蛋白纯化。
参考文献
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