作者：李瑞芳， 赵娜， 刘凤玲， 张丽芸， 陈政良
【摘要】 目的: 探索甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因GGA57GAA点突变引起免疫缺损的机制。方法: 采用PCR从质粒pMBLm57中扩增含GGA57GAA点突变的MBL基因， 构建重组真核表达载体， 电转染CHO细胞， 以Zeocin筛选并克隆化培养， 用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析纯化目的蛋白， 以SDS-PAGE、 Western blot、 ELISA、 配体结合试验、 C4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果: 重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株; 37Glu突变型MBL蛋白主要以双链（Mr约60000）存在， 不能形成高聚体; 其配体结合能力低下， 与MASP-2N端蛋白的结合能力也降低， 不能通过凝集素途径激活补体系统。结论: GGA57GAA点突变产生结构有缺陷的MBL蛋白， 进而影响其识别功能和效应功能。
【关键词】 甘露聚糖结合凝集素 GGA57GAA突变体 37Glu突变型蛋白 识别功能 效应功能
甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin， MBL）是肝细胞分泌的血浆蛋白， 为C型凝集素超家族中胶凝素家族成员［1］。MBL的糖识别域（carbohydrate-recognition domain， CRD）是其识别功能区， 可选择性识别多种病原体表面以Man、 ManNAc、 GlcNAc等为末端糖基的糖结构; 胶原样区（collagen-like region， CLR）为其效应功能区， 通过与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBL associated serine protease， MASP）相互作用， 激活补体凝集素途径， 发挥溶菌和调理功能， 还能与吞噬细胞胶凝素受体结合而发挥直接调理作用［1， 2］。已发现3个可引起调理吞噬缺损的MBL结构基因点突变， 分别位于外显子1 的第54、 57和52位密码: GGC54GAC和GGA57GAA， 其编码产物Gly为Asp或Glu取代; CGT52TGT的编码产物Arg变为Cys。这些点突变为常染色体显性遗传， 其基因频率GGC54GAC在欧亚人群中较高（≥0.11）， GGA57GAA在次撒哈拉非洲人群中很高（达0.29）， 而CGT52TGT在所研究过的人群中较低（≤0.06）［3， 4］。我们对中国十余个民族的群体研究发现， 其MBL基因点突变的频率多在0.1以上。显然， MBL缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此， 阐明MBL基因突变引起免疫缺损的机制具有极其重要的意义。本课题组将人3种突变型MBL基因在COS7细胞中瞬时表达， 证明MBL这些点突变不影响MBL蛋白的合成与分泌［5］; 将CGT52TGT、 GGC54GAC突变体基因在CHO细胞中稳定表达， 发现32Cys和34Asp突变型MBL蛋白的寡聚化程度大大低于重组野生型和天然MBL蛋白［6， 7］。那么， GGA57GAA突变的影响是否同52、 54位密码突变一样？ 本研究中， 我们将GGA57GAA突变体基因在CHO细胞中稳定表达， 并对37Glu突变MBL蛋白进行初步的结构和生物学活性研究。
1 材料和方法
1.1 材料 含人GGA57GAA MBL突变体全长编码区基因的质粒pMBLm57［8］、 重组野生型MBL蛋白［9］、 人血浆天然MBL蛋白［10］、 重组人MASP2-N端蛋白以及抗人MBL CRD单克隆抗体（monoclonal antibody， mAb）、 MBL缺陷型人血清（基因型为LYPB/LYPB）、 质粒pcDNA4/HisMax C和大肠杆菌TOP10F`为南方医科大学免疫学教研室构建、 制备和保存。限制性内切酶、 Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 DNA marker和逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。高相对分子量（Mr）和低Mr蛋白marker购自晶美公司。HRP-羊抗鼠IgG抗体购自鼎国公司。质粒小量快速抽提试剂盒和DNA小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物公司。RPMI1640培养基、 新生牛血清和Zeocin购自Invitrogen公司。Ni2+-NTA Agarose购自Qiagen公司。抗人C4d单克隆抗体(mAb)购自Quedel公司。抗人MBL mAb ［HYP 131-11］购自Abcam公司。CNBr活化的Sepharose 4B购自Amersham Biotech公司。抗His mAb购自TIANGENE公司。Centricon Plus-20超滤膜（Mr cut-off 10000）购自Millipore公司。甘露聚糖购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 真核表达载体的构建与鉴定 上游引物5′-CGGGATCCATGTCCCTGTTTCCATCA-3′， 含BamH Ⅰ酶切位点; 下游引物5′-CGGAATTCACTCACAGACCCTTCAGATAGGGAACT-3′， 含EcoR I酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pMBLm57质粒为模板， 以上述引物进行PCR扩增带有GGA57GAA点突变的MBL cDNA片段， 回收、 纯化PCR产物。将cDNA片段与pcDNA4/HisMax C质粒分别经BamH I和EcoR I双酶切后， 以T4 DNA连接酶于16℃连接8 h， 将目的基因片段插入pcDNA4/HisMax C质粒中， 转化大肠杆菌TOP10F′， 以25 mg/L Zeocin筛选阳性克隆。小量提取质粒， 用BamH I和EcoR I双酶切鉴定， 经双向测序（由上海博亚公司进行）确证后， 大量扩增。鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA4/HisMax C-MBLm57。
1.2.2 CHO细胞的转染、 筛选及克隆化 于0℃在950 μF、 250 V电击下， 将重组表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞。具体操作参照Bio-Rad公司电穿孔仪操作手册。将转染后的CHO细胞置12孔板内培养24 h后， 以800 mg/L Zeocin加压筛选。1周后， 挑取单克隆细胞以相同浓度Zeocin继续加压筛选20 d。随后的1个月中， 每隔3~5 d换液1次， 维持Zeocin的浓度为200 mg/L。稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株命名为CHO-MBLm57。
1.2.3 外源基因表达的RT-PCR分析 以1 mL TRIzol试剂提取1×107个CHO-MBLm57细胞总RNA后， 采用逆转录试剂盒获取cDNA产物。以cDNA产物为模板， 上述1对特异性引物进行PCR， 用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
1.2.4 MBL-CRD mAb亲和层析柱的制备 参照文献［11］方法， 将MBL-CRD mAb与活化Sepharose 4B偶联， 制备MBL-CRD mAb-Sepharose 4B层析柱。
1.2.5 重组蛋白的纯化 (1)收集CHO-MBLm57细胞培养上清， 缓慢加入饱和 (NH4)2SO4溶液至终浓度为60%， 于4℃搅拌2 h沉淀蛋白， 以8000 r/min于4℃离心30 min。将沉淀溶于0.01 mol/L PBS (pH7.4， 含0.5 mol/L NaCl)中， 装透析袋， 在PBS中于4℃透析24 h， 每4~6 h换液1次。(2)以0.45 μm微孔滤膜过滤， 以1 mL/min速度上样MBL-CRD mAb-Sepharose 4B柱， 重复3次后于4℃反应2 h。以10倍柱床体积PBS淋洗， 至A280&<0.05; 用5倍柱床体积0.1 mol/L Gly-HCl（ph3.4）洗脱， 流速为1.5 mL/min， 收集洗脱液， 立即以1 mol/L Tris-HCl(pH9.0)中和pH值至7.0~7.2。(3)将初步纯化蛋白用平衡盐溶液（pH8.0）于4℃透析12 h， 每4~6 h换液1次。上样Ni2+-NTA agarose进行层析， 具体操作见Ni2+-NTA agarose层析柱说明书。目的蛋白于50 mmol/L PBS（pH7.2）中充分透析去除咪唑及盐类， 经超滤浓缩后即为37Glu突变型MBL蛋白。
1.2.6 SDS-PAGE和Western blot检测 将37Glu突变型和重组野生型MBL蛋白上样进行SDS-PAGE， 部分胶进行常规染色; 另一部分用于Western blot检测: 电转移后， 将硝酸纤维素膜膜置于30 g/L脱脂奶粉中于4℃封闭过夜; 加1∶3000稀释抗His mAb于室温反应1 h， 洗膜5次; 加1∶4000稀释HRP-羊抗鼠IgG， 室温反应1 h， 洗涤后以DAB/NiCl2底物液显色。
1.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将37Glu突变MBL蛋白从20 mg/L倍比稀释至0.6 mg/L， 加入酶联板中， 100 μL/孔， 以天然MBL蛋白和重组野生型MBL蛋白为阳性对照，稀释液为阴性对照， 4℃包被过夜; 加入50 g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2 h; 洗涤后， 分别加入1∶5000抗人MBL mAb［HYP 131-11］、 1∶1000抗人MBL-CRD mAb或1∶5000抗His mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后加入1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L h3SO4终止反应， 在酶联仪上测A450值。
1.2.8 配体结合试验 将10 mg/L甘露聚糖加入酶联板中， 100 μL/孔， 4℃包被过夜; 加入50 g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2 h; TBS-T（含10 mmol/L Ca2+）洗涤后， 分别加入不同浓度（0.6 ~10 mg/L）的天然MBL、 重组野生型MBL和37Glu突变MBL蛋白， 100 μL/孔， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加入1∶5000抗人MBL mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加入1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L h3SO4终止反应， 在酶联仪上测A450 值。
1.2.9 重组蛋白与MASP2-N端蛋白结合试验 将10 mg/L纯化重组人MASP2-N端蛋白加入酶联板， 100 μL/孔， 4℃包被过夜; 加入50 g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2 h; TBS-T(含10 mmol/L Ca2+) 洗涤后， 加入不同浓度（0.03~1 mg/L）人血浆来源天然MBL、 重组人野生型MBL和37Glu突变型MBL蛋白， 37℃反应1 h， 对照组稀释液中含10 mmol/L EDTA; 洗涤后， 加入1∶1000鼠抗人MBL-CRD mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加入1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L h3SO4终止反应， 在自动酶联仪上测定A450值。
1.2.10 C4d沉积试验 将100 mg/L甘露聚糖加入酶联板， 100μL/孔， 4℃包被过夜; 加50g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2h; TBS-T（含10mmol/L Ca2+）洗涤后， 加不同浓度（0.6~10mg/L）重组野生型和37Glu突变型MBL蛋白， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加1∶50稀释MBL缺陷型人血清， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加1∶5000鼠抗人C4d mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L h3SO4终止反应， 在酶联仪上测A450值。
2 结果
2.1 真核表达载体的构建 采用PCR获得长约750 bp的cDNA片段， 将其定向插入真核表达载体中， 构建重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm54。经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切， 可见2条带， 其中约750 bp带为目的片段。以特异性引物进行PCR， 亦获得长约750 bp的片段（图1）。通过DNA测序， 确认插入DNA片段的序列与预期结果完全一致， 带有GGA57GAA点突变。
图1 重组质粒的鉴定（略）
1: λEcoT14Ⅰ DNA marker; 2: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57的EcoR I酶切产物; 3: 质粒pcDNA4/HisMax C的EcoR I酶切产物; 4: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57的EcoR I和BamH I双酶切产物; 5: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57的PCR产物.
2.2 CHO-MBLm57细胞的筛选与克隆化培养 采用电穿孔法， 将重组表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞， 经长达近2个月的Zeocin加压筛选和维持培养， 获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株， 分别命名为B4-CHO-MBLm57、 C7-CHO-MBLm57、 F6-CHO-MBLm57、 G5-CHO-MBLm57和G9-CHO-MBLm57。
2.3 CHO-MBLm57细胞内目的基因mRNA的表达 提取1×107个CHO-MBLm57细胞的总RNA， 经RT-PCR扩增， 得到长约750 bp的片段， 与预期结果一致（图2）。
图2 RT-PCR鉴定目的基因mRNA（略）
1: DL 2000 DNA marker; 2: 质粒pcDNA4/HisMax C转染CHO细胞的RT-PCR产物; 3: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞的RT-PCR产物.
2.4 37Glu突变型MBL蛋白的分子质量与抗原性 经硫酸铵粗沉淀及两步亲和层析， 从1 L细胞培养上清中可得到约1 mg蛋白。SDS-PAGE分析发现， 在非还原状态下， 37Glu突变MBL蛋白在Mr 60000处有1条明显的带， 在Mr 200000处见1条很弱的带， 而重组野生型MBL蛋白则在Mr&>200000处可见多条明显条带， 在60000处只有非常微弱的条带。Western blot结果显示， 37Glu突变型MBL蛋白在Mr 60000处呈现1条能与抗His抗体反应的条带， 而重组野生型MBL蛋白的染色带则主要在Mr&>200000处（图3）。ELISA表明， 重组37Glu突变MBL蛋白能为抗His、 MBL-CRD或MBL的mAb所识别（图4）。
图3 SDS-PAGE和Western blot分析纯化的重组表达产物（略）
1: 蛋白marker; 2: 重组野生型MBL; 3: 重组37Glu突变型MBL; 4: 重组野生型MBL的Western blot图; 5: 重组37Glu突变型MBL的Western blot图.
2.5 37Glu突变型MBL蛋白的配体结合能力 配体结合试验结果显示， 37Glu突变MBL蛋白无糖结合能力， 而天然MBL和重组野生型MBL蛋白与甘露聚糖有良好的结合活性（图5）。
图4 37Glu突变型MBL蛋白与抗体的结合(n=3)（略）
图5 37Glu突变型MBL蛋白与甘露聚糖的结合(n=3)（略）
2.6 37Glu突变型MBL蛋白与MASP2-N端蛋白的结合能力 结合试验显示， 人天然MBL和重组野生型MBL蛋白对MASP2-N端蛋白有良好的结合活性， 但37Glu突变MBL蛋白则否（图6）。
图6 37Glu突变型MBL蛋白与甘MASP2-N端蛋白的结合(n=3)（略）
2.7 37Glu突变型MBL蛋白激活补体的活性 重组野生型MBL蛋白能通过凝集素途径激活补体， 裂解C4产生C4d， 而37Glu突变型MBL蛋白激活补体的活性几乎完全消失（图7）。
图7 37Glu突变型MBL蛋白激活补体的作用(n=3)（略）
3 讨论
人MBL肽链Mr为27000~32000， 3条肽链构成结构单位， 完整的MBL分子是这种结构单位的寡聚体， 多至六聚体［1， 2］。MBL的结构如此复杂， 在原核系统是无法表达的。因此， 我们选用真核表达载体和哺乳动物细胞进行研究， 以期模拟MBL基因在人类细胞中表达的情况。本实验选择真核表达载体pcDNA4/HisMax C和CHO细胞作为研究系统， 构建的重组表达载体经DNA测序确证MBL基因中含GGA57GAA点突变， 然后将其转染CHO细胞中表达。真核表达的关键之一在于能否筛选到稳定高效的表达细胞株。由于pcDNA4/HisMax C含有Zeocin抗性基因， 我们用Zeocin持续加压转染细胞近2个月， 最终筛选到5株稳定表达株。采用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析法纯化37Glu突变型MBL蛋白， 效果比较满意， 获得了较高纯度的目的蛋白。
已发现3个可引起免疫缺损的MBL结构基因点突变， 但对其引起调理吞噬缺损的机制了解不多。我们先前的研究证明， MBL 结构基因的3个点突变均不影响MBL蛋白的合成与分泌［5］， 本实验成功地获得分泌性表达37Glu突变MBL分子的CHO细胞株和重组37Glu突变MBL蛋白， 亦表明GGA57GAA点突变并不影响其产物的表达及向胞外分泌的过程。应用SDS-PAGE和Western blot分析， 发现37Glu突变MBL蛋白主要是Mr 60000的分子， 这应该是MBL肽链的双体， 其寡聚化程度大大低于重组野生型MBL， 高寡聚化的MBL分子极少。这与我们对32Arg［6］和34Asp［7］突变蛋白的研究结果相似。功能实验发现， 37Glu突变型MBL蛋白不能与配体甘露聚糖结合， 亦缺乏与MASP-2N端蛋白结合的能力， 从而导致其激活补体凝集素途径的活性几乎完全消失。MBL分子的寡聚化程度与其CLR密切相关， 而寡聚化程度直接影响其功能， 只有四聚体以上的多聚体才具生物学活性［12］。因此有理由推论， 因GGA57GAA点突变产生的带有巨大侧链和电荷的Glu代替了无侧链且电中性的Gly， 影响了3条肽链CLR α-螺旋的形成， 从而妨碍了MBL结构单位和/或寡聚体的装配， 即产生了结构有缺陷的MBL分子， 并进而影响其功能活性。同时亦表明， MBL肽链第57位Gly残基对于维持完整MBL分子的结构和功能是必需的。
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