牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用

【摘要】 目的: 利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域(LBD)片段， 纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。方法: 以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段， 与原核表达载体pGEX 4T1相连， 构建原核表达质粒pGEX/β6LBD， 测序确认开放阅读框正确后， 转化感受态细胞BL21(DE3)， 以IPTG诱导表达重组牛β6LBD融合蛋白。SDSPAGE和Western blot鉴定后提取包涵体， 电泳分离纯化重组融合蛋白， 免疫新西兰白兔制备多克隆抗体， 以ELISA、 琼脂扩散实验、 免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。结果: 重组牛β6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达， 重组蛋白主要以包涵体形式表达， 相对分子质量（Mr）约为45000。制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800 以上， 该抗体可与牛舌上皮细胞中的抗原分子结合， 具有很好的特异性。结论: 实现了牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的原核表达和抗体制备， 为研究受体β6亚基在牛体内的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。

【关键词】 牛FMDV受体 β6LBD 多克隆抗体 免疫组化

　　口蹄疫是由口蹄疫病毒（footandmouth disease virus， FMDV）引起偶蹄动物（牛、 猪、 羊、 骆驼等）共患的一种急性、 热性、 接触性传染病， 世界动物卫生组织（OIE）和中国政府分别将该病列为A类和一类动物传染病之首。FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属。完整的病毒由衣壳包裹一个分子的RNA组成， 衣壳由4种结构蛋白VP1、 VP2、 VP3和VP4组成的60个不对称原粒构成， 其中VP1、 VP2和VP3位于衣壳表面， 而VP4则完全位于衣壳里面。由VP1 140～160位的氨基酸形成的GH环突出于表面， GH环含有高度保守的RGD基序。整合素（integrin）分子可与含有RGD基序的蛋白配体结合， 这是整合素成为FMDV受体的分子基础[1]。病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的一个决定因素[2]。目前已发现至少有αvβ1、 αvβ3、 αvβ6、 αvβ6 四种整合素是FMDV的受体[3， 4]， 且αvβ6是主要的功能受体[5]。β6是异源二聚体αvβ6的一个亚基， 单独存在时并不能介导FMDV感染。β6亚基胞外域中的168个氨基酸参与构成了配体结合域（ligandBinding domain， LBD）[6]。FMDV具有严格的宿主范围， 自然条件下其感染对象是猪、 牛、 羊及其他家养和野生偶蹄动物[7]。FMDV受体的发现均是以人源整合素基因进行受体重建实验的。已有实验表明， 与人源整合素相比较， FMDV能更加有效地利用牛源整合素[6]， 本研究组继制备了兔抗牛αvLBD多克隆抗体后[8]， 其试验实现了牛β6LBD的高效表达并制备了兔多克隆抗体。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 含有牛FMDV受体β6亚基基因的重组质粒pGEMβ6由本研究组构建（该基因在GenBank中的登录号为DQ867017）; 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 IPTG、 Taq DNA聚合酶、 核酸marker、 DNA片段纯化试剂盒均购自宝生物（大连）工程公司; 低分子量蛋白marker购自中国科学院上海细胞生化所; 大肠杆菌菌株DH5α（克隆宿主）、 BL21（DE3）（表达宿主）、 原核表达载体pGEX 4T1、 FMDV实验感染牛舌组织均由本室保存; 溶菌酶、 弗氏佐剂均为Sigma公司产品; 硝酸纤维素（NC）膜、 透析袋为Pharmacia公司产品; HRP标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG、 DAB显色试剂盒、 GST单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 其他试剂均为国产或进口分析纯。健康新西兰大白兔（3月龄， 雄性， 体质量约2.5 kg）由兰州兽医研究所实验动物场提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 参考Duque等[8]的文献报道设计引物， 上游引物P1为5′GTGGGATCCCCTCAAAGCTTGGCTCTTAA3′; 下游引物P2为5′CGACTCGAGGTCCGCGTCACTCACAAAGA3′， P1和P2引物的5′端分别引入了酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ， 这对引物用于扩增牛β6 LBD片段， 预期大小为504 bp。

　　1.2.2 重组质粒的构建 以重组质粒pGEMβ6为模板， P1和P2为扩增引物进行PCR反应。扩增得到的片段经BamHⅠ/XhoⅠ 双酶切后与同样酶切处理的pGEX 4T1载体连接， 转化大肠杆菌DH5α， 随机挑取单个菌落小剂量制备质粒， PCR、　　酶切鉴定重组质粒， 将初步确定为阳性的重组质粒pGEX/β6LBD委托宝生物（大连）工程公司测序。

　　1.2.3 重组蛋白的诱导表达 将测序正确的重组质粒pGEX/β6LBD转化大肠杆菌BL21(DE3)， 挑取单菌落接入10 mLLB/Ampr培养基中， 37℃振摇培养过夜， 次日按 1∶100 将菌液接入LB/Ampr培养液， 37℃振摇培养2～4 h至A600值达到0.3～0.5时， 加IPTG至终浓度1 mmol/L， 继续培养4～6 h 后进行SDSPAGE分析目的蛋白的诱导表达情况。同时进行Western blot， 将表达的蛋白经SDSPAGE并膜转移后， 用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h， 一抗为GST mAb， 二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG， 依次加入DAB和h3O2显色。

　　1.2.4 可溶性分析和纯化 取单个克隆阳性表达菌接入200 mLLB/Ampr培养液中， 按上述方法诱导表达， 离心收集沉淀。加细菌裂解液， 于冰浴上进行超声破碎， 超声时间10 s， 间隔时间10 s， 功率400 W， 超声次数40次， 4℃ 15000 r/min离心20 min， 分别取上清和沉淀用于SDSPAGE分析。沉淀加适量1×上样缓冲液， 重悬后沸水煮5 min后上样， 电泳结束后用预冷的0.1 mol/L KCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带， 在相应位置切下目的条带放入透析袋内， 将透析袋置于水平电泳洗脱装置内， 60V洗脱7 h， 然后反转电极向相反方向洗脱3～5 min。取出透析带内凝胶， PEG20000包埋浓缩透析袋内液体至一定体积， 取样进行SDSPAGE电泳， 鉴定重组蛋白的纯度和浓度。

　　1.2.5 多克隆抗体的制备 以纯化的牛β6LBD融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔。免疫前取耳静脉血分离血清， 作为免疫前血清对照。初次免疫用500 μg重组蛋白， 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀后于背部皮下多点注射。4周后第1次加强免疫用250 μg重组蛋白， 与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。之后隔2周加强免疫1次， 并于2次加强免疫后第10天经心脏大量采血， 按常规方法分离制备血清。以重组蛋白包被96孔板， 间接ELISA方法测定抗血清效价。

　　1.2.6 多克隆抗体的免疫组化染色 从-20℃取出FMDV实验感染牛舌组织冰冻切片， 复温后置于4℃预冷的丙酮固定10 min， PBS漂洗3次后， 滴加h3O2 甲醇， 室温孵育10 min， 滴加1∶200稀释的兔抗牛β6LBD融合蛋白多克隆抗体， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入1∶100稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG， 37℃孵育1 h， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后中性树脂封片， 显微镜下观察并拍照记录结果。

　　2 结果

　　2.1 重组原核表达质粒的构建 以pGEMβ6为模板PCR扩增出了牛β6亚基LBD 504 bp的片段， 编码168个氨基酸。将该片段克隆至pGEX 4T1原核表达载体， PCR、 酶切结果显示目的片段与预期大小一致， 测序结果显示重组质粒pGEX/β6LBD含有正确的开放阅读框。

　　2.2 重组融合蛋白的诱导表达和纯化 将重组质粒pGEX/β6LBD转化大肠杆菌BL21(DE3)， 以IPTG诱导表达重组β6LBD蛋白。SDSPAGE分析表明， 重组菌经IPTG诱导后在45000处可看到一条特异的蛋白条带， 与预期表达的目的蛋白大小一致， 未经IPTG诱导的阴性对照在此位置未见该条带。Western blot分析显示， GST mAb与表达菌体中的重组融合蛋白形成了特异的抗原抗体反应带。细菌沉淀经超声裂解获得其包涵体， 表明重组融合蛋白以包涵体形式存在于菌体中。包涵体经SDSPAGE后切胶电泳洗脱纯化， 获得了高纯度的重组融合蛋白（图1）。

　　图1 表达产物的SDSPAGE和Wester blot检测（略）

　　1: 未诱导对照; 2-4: 分别为IPTG诱导3 h， 4 h， 5 h表达产物; M: 蛋白marker; 5: 纯化的目的蛋白; 6: 目的蛋白Wester blot分析.

　　2.3 多克隆抗体的鉴定 以牛β6LBD融合蛋白3次免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。以2 mg/L的重组蛋白包板， 间接ELISA法测定兔抗血清效价在1∶12800左右。牛舌组织免疫组化实验表明， 牛整合素β6亚基仅分布于舌上皮细胞， 尤其在棘细胞层表达量较大， 在固有层与肌层无分布（图2）， 这与Monaghan等[5]报道的牛αvβ6分布于舌上皮组织的结论相一致。

　　图2 牛β6LBD多克隆抗体免疫组化结果（略）

　　A: 阴性血清对照(×200); B: 抗牛β6LBD多克隆抗体免疫组化染色(×200); C: 抗牛β6LBD多克隆抗体免疫组化染色(×400).

　　3 讨论
　　
　　整合素广泛分布于生物体的组织细胞中， 具有广泛的生物学活性， 在细胞的生长、 移行、 增殖和分化等许多方面发挥重要作用。许多病毒能利用整合素分子作为病毒受体或共受体（coreceptor）进入宿主细胞。整合素是一类由α和β亚基以非共价键结合形成的膜蛋白家族， 该家族包括由18种不同的α亚基和8种β亚基形成的24种αβ复合物。在这些复合物中， αvβ1、 αvβ3、 αvβ6、 αvβ8、 αvβ5、 α5β1、 α8β1、 αⅡbβ38种整合素能够识别精氨酸甘氨酸天冬氨酸（ArgGlyAsp， RGD）序列而与其配体相互作用[9]， 已发现前4种是FMDV的受体， 后4种尤其是αvβ5和α5β1已被许多实验证实并非FMDV受体[10]。整合素的α和β链的氨基末端形成的球形部分为细胞外配体结合域， 该结合域在细胞信号转导过程中扮演重要角色， 但是， 整合素作为FMDV的受体在病毒感染细胞过程中引发何种信号转导途径目前尚无证据。
　　
　　Jackson等[4]发现正常情况下不感染FMDV的人SW480细胞在转染了人整合素β6 cDNA后， 即变得对FMDV易感， 且这种介导作用可被抗αvβ6的mAb所抑制， 从而证实了αvβ6是FMDV的受体。β6亚基仅形成一种异二聚体即αvβ6， 人的子宫、 膀胱、 呼吸道和唾液腺等不同部位的上皮细胞都发现有αvβ6表达。牛在感染FMDV后， αvβ6在病毒靶器官的上皮细胞表面持续性表达， 却检测不到αvβ3的表达， 这表明αvβ6可能在FMDV感染的初始阶段起重要作用[5]。最新研究表明， αvβ6整合素不仅对FMDV吸附起作用， 而且在病毒的脱壳、 复制等过程中也发挥着重要作用[10]。我们在克隆到FMDV受体牛β6亚基基因的基础上， 选择以其配体结合域为研究切入点， 实现了该结合域的高效表达并制备了兔多克隆抗体。本研究中选用的表达载体为pGEX 4T1， 在该载体多克隆位点的Nh3末端带有Mr为26000的谷胱甘肽转移酶(GST)标签， 该标签有助于小Mr蛋白的高效表达。对于一种蛋白质说来， 抗体是研究其功能最有力的工具之一。目前， 市面上没有商品化的抗牛β6蛋白的抗体可以利用， 这限制了人们对牛β6蛋白作为FMDV受体的相关研究。我们制备的兔抗牛β6LBD蛋白多克隆抗体将有助于深入研究牛β6亚基在FMDV感染宿主细胞过程中的作用。另外， FMDV具有明显的组织嗜性， 动物发病时多见舌面、 唇部、 蹄部等的病变， 导致这种表型的致病机理至今鲜有报道， 兔抗牛β6LBD的多克隆抗体将为研究FMDV受体整合素β6亚基的组织分布及其病毒致病机制提供依据。

参考文献

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