人PIWIL3特异性抗体的制备和PIWIL3蛋白在肿瘤组织中的分布

【摘要】 目的: 制备人Argonaute家族中PIWIL3蛋白的特异性抗体， 并检测其在人多种肿瘤组织中的表达和分布。方法: 根据序列同源性和多肽免疫性， 利用内部多肽选择数据库选择最佳的多肽免疫原合成多肽， 再与KLH结合用于免疫; 免疫所得的抗血清经多肽包被的凝胶进行亲和层析纯化， 酶联免疫吸附分析技术(ELISA)检测纯化后抗体与多肽的结合能力， Western blot检测抗体对相应蛋白的结合能力。人肿瘤组织芯片检测该蛋白在多种肿瘤组织的表达和定位。结果: 成功制备特异性人PIWIL3蛋白多克隆抗体。ELISA和Western blot检测均表明该抗体具有很好的结合能力。肿瘤组织芯片检测到PIWIL3蛋白在人星形细胞神经胶质瘤和脑脊膜瘤胞质中表达。结论: 应用内部多肽选择数据库可以得到最佳的多肽免疫原， 以区分亚家族中其他有高度序列同源性的蛋白， 成功制备出纯度和结合能力均较好的特异性人PIWIL3抗体， 对研究人类特定肿瘤的发病具有潜在的应用价值。

【关键词】 人PIWIL3蛋白 多肽免疫原 多克隆抗体 肿瘤组织芯片

　　小干扰RNA (small interfering RNAs， siRNA)和微小RNA(miRNA)均属于非编码的小RNAs(noncoding small RNAs)， 它们通过进化上高度保守的机制使靶基因沉默， 对转录和转录后水平基因表达的调节有重要作用。miRNA/RNAi途径的核心——RNA诱导沉默复合体(RNAinduced silencing complex， RISC)是RNAi的效应器， 而RISC的中心作用元件则是Argonaute蛋白家族。该蛋白家族是一类相对分子质量(Mr)约100000的序列高度保守的蛋白质， 包括PIWIL1～4和eIF2C1/ago1～eIF2C4/ago4两个亚家族， 家族中的成员均含有2个RNA结合结构域， 即PAZ和PIWI结构域， 与特异性清除目标mRNA， 促进miRNA/siRNA释放有关［1］。其中， 不同的PIWIL蛋白质有着不同的生物学功能。现认为， 由PIWI/Argonaute家族蛋白参与microRNA(miRNA)所介导的翻译抑制作用是一种新的基因调节机制［2］， 因此， 深入研究PIWIL1～4各蛋白的生化及遗传学性质有助于最终揭示这些蛋白参与人类许多疾病的基本生物学机制。本实验我们通过内部多肽选择数据库获得最佳的多肽免疫原， 制备人Argonaute家族中亚家族成员PIWIL3蛋白的特异性抗体， 并利用人肿瘤组织芯片行免疫组化检测， 初步探讨PIWIL3蛋白在人类疾病， 尤其是肿瘤发病机制中的潜在作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级雄性的健康新西兰大白兔(2只2月龄、 体质量2.0～3.0 kg)购自中国科学院上海实验动物中心。钥孔冒贝血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanine， KLH)、 SMCC、 SulfoLink Coupling Gel购自Pierce公司。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自Sigma公司。P10柱购自BioRad公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购自RockLand公司。ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。40点人多种类型肿瘤组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制作。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PIWIL3蛋白特异性肽片段的筛选和合成 由Ensembl数据库获得人PIWIL3蛋白序列， 采用Software筛选PIWIL3蛋白特异性的肽片段(19#)， 在C末端加上半胱氨酸(Cysteine)用于肽片段与载体蛋白KLH连接， 特异性肽片段的氨基酸序列为EPGPEAGLHTAPLC。多肽片段由CStrong公司合成， 经质谱分析表明合成的多肽片段与多肽的理论Mr一致， 反相HPLC检测纯度在95%以上。

　　1.2.2 兔源多克隆抗体的制备与纯化 (1)抗原制备: 利用合成的多肽片段C端的Cysteine与SMCC活化的载体蛋白KLH蛋白连接， 经过P10柱层析分离， 收集第一峰， 即肽KLH 复合物， -20℃保存。(2)免疫动物: 按100 μg多肽/次剂量的多肽KLH复合物免疫家兔， 首次用肽KLH复合物加福氏完全佐剂(1∶1)， 皮下及皮内多点注射， 以后每隔14 d加强免疫1次(福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂)， 共免疫4次。第2次后开始耳缘静脉取血测定抗血清效价。1周后颈总动脉放血， 常规方法分离血清， 饱和硫酸胺分段盐析法纯化。(3)多肽与活化凝胶连接: 取10 mg多肽， 以连接缓冲液2 mL（50 mmol/L Tris， 5 mmol/L EDTA， pH8.5）溶解后与2 mL SulfoLink Coupling Gel混合30 min， 再以封闭缓冲液（50 mmol/L Cysteine， pH8.5）封闭30 min。(4)亲和层析法纯化抗体: 以400 g/L硫酸铵沉淀抗血清， 以少量PBS溶解后， 与经大量PBS透析后与相应肽连接的凝胶混合过夜(4℃)。装入P10柱， 置紫外检测装置， 以大量PBS淋洗凝胶， 以洗脱液(0.1 mol/L Glycine， pH3.0)洗脱， 根据280 nm吸收值收集蛋白组分。

　　1.2.3 纯化抗体的检测 (1)SDSPAGE检测抗体的纯度: 采用125 g/L凝胶进行还原型电泳分析， 上样量为5 μg/泳道。(2)合成多肽作为免疫吸附剂对兔抗血清的ELISA检测: 将合成多肽作为抗原包被到96孔反应板中， 0.5 μg/孔， 抗体以封闭缓冲液稀释至1 mg/L， 再倍比稀释7个梯度， 以0.5 mg/L无关兔IgG作为阴性对照。采用TMB显色， 测定A450值， 与阴性对照的比值大于或等于2判为阳性。(3)Western blot检测: 制备的兔抗PIWIL3抗体用含牛血清白蛋白(BSA)的TBS按1∶500稀释， HRP标记的山羊抗兔IgG抗体为二抗， 采用对数生长期的HeLa细胞总蛋白进行分析， 采用化学发光法检测。对照组采用多抗稀释液作为一抗。(4)免疫组织化学检测(IHC): 制备的兔抗PIWIL3抗体按1∶100稀释， 采用40点人多部位肿瘤组织芯片， 用二步法进行IHC研究。结果以染成清晰的棕黄色为阳性染色。

　　2 结果

　　2.1 抗血清效价的鉴定 采用ELISA方法检测免疫2次后抗血清的效价以判断动物对多肽抗原的应答， 结果为128 K; 检测末次免疫后收获的抗血清的效价为256 K。经过3次免疫后出现强烈的免疫反应， 效价在128～256 K， 第4和第7次后效价没有出现明显的变化。

　　2.2 纯化抗体的鉴定

　　2.2.1 纯化抗体的得率 末次免疫后第7天家兔经颈动脉采血收获全血， 获取抗血清， 经多肽包被的凝胶进行亲和层析法纯化抗体， 纯化的抗体量为18 mg。

　　2.2.2 SDSPAGE检测抗体纯度 采用125 g/L还原型电泳分析， 结果表明， 主要蛋白条带Mr在50000位置， 符合兔IgG的基本特征， 同时也表明， 抗体的纯度也较高(图1)。

　　图1 SDSPAGE检测纯化的PIWIL3蛋白(19#)（略）

　　Fig 1 The SDSPAGE of the puried PIWIL3 protein (19#)

　　2.2.3 ELISA检测纯化后的抗体及与相应多肽的结合能力 经多肽偶联的凝胶亲和层析所纯化的抗体和对应的多肽均有很好的结合能力， 当抗体浓度在0.25 mg/L时结合能力最高(图2)。

　　图2 ELISA检测经亲合层析法纯化的19#抗体（略）

　　Fig 2 ELISA detecting the PIWIL3(19#) antibodies puried by affinity chromatography

　　2.2.4 Western blot检测抗体的结合能力 人PIWIL3蛋白克隆自HeLa细胞， 因此对HeLa细胞株的总蛋白进行Western blot检测， 确定抗PIWIL3抗体(19#)对相应蛋白的结合能力(图3)。

　　图3 Western blot检测PIWIL3抗体对HeLa细胞株相应蛋白的结合能力（略）

　　Fig 3 The Western blot analysis of the binding energy of PIWIL3 antibody to the corresponding protein in Hela cell line

　　2.2.5 免疫组织化学检测 本抗体阳性染色定位于胞质。利用人40点多种肿瘤组织芯片进行检测表明， PIWIL3蛋白在人星形细胞神经胶质瘤和脑膜瘤表达(图4A、 B)。消化道肿瘤(图4C、 D)等肿瘤组织呈阴性表达。

　　图4 40点人肿瘤组织芯片行免疫组织化学染色检测PIWIL3蛋白表达（略）

　　Fig 4 Expressions of PIWIL3 protein in 40 dots human tumor tissues chips using immunohistochemistry(×200)

　　A: The positive expression in human astrocytic glioma cytoplasma; B: The positive expression in meningioma cytoplasma; C: The negative expression in oesophagus squamous cancer cytoplasma; D: The negative expression in colon cancer cytoplasma， but positive expressions were observed in small parts of blood vessels walls and muscle cytoplasma.

　　3 讨论
　　
　　与Argonaute蛋白相关的小RNAs可作为序列特异性的向导调节mRNA稳定性、 蛋白合成、 染色体组建以及基因组结构。在动物中， Argonaute蛋白的2个亚家族应用20个左右核苷酸的RNAs作为向导， 作用于RNA干扰和microRNA介导的基因调节。其中， PIWIL亚家族虽然参与了种系干细胞维持和减数分裂的调节， 但其生化功能以及它们的小RNAs向导的本质却不明确［3， 4］， 与人类疾病的关系也有待深入的研究。制备人类Argonaute蛋白8个家族成员的兔源性多克隆抗体将对有利于研究它们在人类组织中的定位和功能， 以及与人类疾病发病机制的关系。在本研究中， 我们制备了其中一个亚家族成员PIWIL3的特异性抗体。

　　3.1 PIWIL3多克隆抗体多肽的选择、 生产和检验 本实验中， 我们制备了PIWIL亚家族中的PIWIL3多克隆抗体。由于多克隆抗体的制备需要纯度较高的天然抗原， 在实验中我们先由Ensembl数据库获得人PIWIL3蛋白序列， 并经过确认，然后应用一种被称为抗体设计师的内部多肽选择数据库来选择最佳多肽免疫原， 使之能区分亚家族中其他有高度序列同源性的蛋白用于人PIWIL3蛋白抗体的生产。多肽抗体的生产通常用疏水性弱、 抗原性强、 长度为10～30 个氨基酸的多肽作为免疫原来生产抗体。我们的多肽选择数据库考虑到了多肽的序列独特性(该独特性是基于与所有人蛋白序列比较后的数据得到的)、 抗原性、　　合成难度和溶解性。该数据库可为覆盖整个蛋白序列的重叠多肽， 以及选定的用于抗体生产的最佳肽段打分。针对PIWIL3， 合成出多肽并将其与KLH结合用于免疫。在兔体内免疫3次之后， 该多肽显示出强免疫反应， 且在96孔板上用固定化免疫原肽段进行ELISA检测时显示出了高滴度。兔源抗体用相应的多肽进行了亲和纯化， 可提纯到2～20 μg 亲和纯化抗体。

　　3.2 应用组织芯片分析PIWIL3蛋白的表达 免疫组化实验表明， 本实验我们制备的PIWIL3抗体在肿瘤细胞质有特异性反应。该结果揭示人PIWIL3蛋白集中表达于特定种类的肿瘤细胞(如星形细胞神经胶质瘤和脑膜瘤)的胞质中， 可能参与了这些肿瘤细胞的生长调控， 其机制还需进一步的研究来确认。在人类其他部位的肿瘤， 如消化道肿瘤中未见该抗体的表达， 这种抗体器官选择性表达现象的内在机制和意义有待深入研究。
　　
　　目前关于RNA干扰和microRNA调控过程中一些重要蛋白的功能研究报道很少。现有的报道认为人体内AGO1与wilms肾癌和神经外胚层瘤有关。AGO2蛋白也与肿瘤存在一定关系［5］。但关于该家族中另一个亚家族PIWIL蛋白的功能研究几乎尚未见报道。制备PIWIL蛋白中各组成蛋白(PIWIL1～4)的特异性抗体， 无疑有助于阐明其在组织中的定位和功能， 同时也为设计利用miRNAs治疗肿瘤等疾病的药物提供了靶点和研究工具。

　　3.3 人PIWIL3蛋白特异性抗体的应用 本抗体对肿瘤细胞， 尤其是神经系统肿瘤表现出很强的特异性， 可用于确定肿瘤来源。如果是起源于神经系统的肿瘤， 则本抗体与之产生特异性结合， 在免疫组化反应时显示阳性染色。

参考文献

　　［1］ Parker JS， Roe SM， Barford D. Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity［J］. EMBO J， 2004， 23(24): 4727-4737.

　　［2］ Grivna ST， Pyhtila B， Lin H. MIWI associates with translational machinery and PIWIinteracting RNAs (piRNAs) in regulating spermatogenesis［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103(36): 13415-13420.

　　［3］ Girard A， Sachidanandam R， Hannon GJ， et al. A germlinespecific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins［J］. Nature， 2006， 442(7099): 199-202.

　　［4］ Kim VN. Small RNAs just got bigger: Piwiinteracting RNAs (piRNAs) in mammalian testes［J］. Genes Dev， 2006， 20(15): 1993-1997.

　　［5］ Baumberger N， Baulcombe DC. Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102(33): 11928-11933.