人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞

【摘要】 目的: 探讨人脐血间充质干细胞体外培养过程中的终末分化方向。方法: 采用密度梯度离心法从人脐血中分离培养间充质干细胞， 流式细胞术（FCM）检测细胞表面抗原标记CD29、 CD44、 CD105、 CD34、 CD106和HLADR; 观察人脐血间充质干细胞在体外培养过程中的增殖情况和形态变化， 应用RTPCR和免疫细胞化学方法对P2和P10代人脐血间充质干细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）的表达情况进行检测。结果: RTPCR分析证实P10代人脐血间充质干细胞有NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测显示P10代细胞能表达NSE和NF， 而P2代人脐血间充质干细胞经RTPCR和免疫细胞化学检测均无NSE、 NF表达。结论: 人脐血间充质干细胞在体外培养过程中能终末分化为神经元样细胞。

【关键词】 间充质干细胞 人脐血 分化 神经元

　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC) 是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞， 最先发现于骨髓， 随后在脐血和其他组织中也发现了MSC。研究报道MSC在体外诱导条件下不仅可分化为成骨细胞、 成软骨细胞、 脂肪细胞和成肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞［1］， 而且还能跨胚层横向分化为神经细胞［2］。我们在分离培养人脐血MSC的过程中发现部分脐血MSC在体外培养多次传代的过程中未经诱导表现为类似神经元的形态， 因此采用RTPCR和免疫细胞化学的方法对脐血MSC能否表达神经元特异性抗原标记进行检测。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 淋巴细胞分离液（1.077 g/mL）购自中科院天津血液病研究所; DMEMLG培养基购自Sigma公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 青/链霉素、 谷氨酰胺、 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA购自Gibico公司; 鼠抗人CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC、 HLADRPE单克隆抗体(mAb)及同型对照购自Coulter公司; 鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase， NSE）和神经丝蛋白（neurofilament， NF）mAb工作液， EliVisionTM Plus试剂盒购自北京中杉生物技术公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR扩增引物 根据GenBank上登录的NSE、 NF基因序列设计， 由上海生工生物工程有限公司合成。NSE引物为: 5′gaagaaaaggcctgcaactg3′， 5′ccaggtcagcaatgaatgtg3′; NF引物为: 5′atcggtaaaggtgcacttgg3′， 5′tctacctccccattgacagc3′。扩增片段长度分别为157 bp和168 bp。

　　1.2.2 脐血标本的收集 脐血来源于南京军区福州总医院妇产科出生的健康足月顺产新生儿。产妇产前检查均正常， 脐血的收集均已征得产妇同意。无菌条件下采集脐血: 待胎儿娩出后， 在距离胎儿5～7 cm的脐带处进行双接扎， 剪断脐带， 穿刺脐静脉后抽取脐血， 每份30～80 mL， 抽取后注入100 mL， 经无菌处理， 加入333.4 nkat/mL肝素抗凝的生理盐水瓶中， 充分混匀。脐血采集后4 h内进行单个核细胞的分离。

　　1.2.3 脐血单个核细胞的分离 采用密度梯度离心法: 脐血30～80 mL用无菌的DHank’s液等体积稀释。取数个50 mL的无菌带盖离心管， 先加入1.077 g/mL的淋巴细胞分离液25 mL， 无菌滴管吸取稀释后的脐血25 mL， 离液面约1 cm处缓慢加入， 形成一明显的界面。2 000 r/min离心20 min， 小心吸取中间的白膜层。加入5倍体积的PBS缓冲液， 1 000 r/min离心10 min， 洗涤3次， 弃上清。所得单个核细胞用于细胞培养。

　　1.2.4 脐血分离细胞的培养和传代 参照骨髓MSC的培养方法［3］从脐血中分离出的单个核细胞以1.0×109/L的密度接种于含体积分数200 mL/L胎牛血清、 2 mmol/L谷氨酰胺、 1667 nkat/mL青/链霉素的DMEMLG培养液中， 置于37℃、 50 mL/L　　 CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。5～7 d后首次换液， 悬浮的细胞被去除， 可见瓶底有少量的贴壁细胞。换上新鲜的培养液继续培养。开始每隔5～7 d换液1次， 待细胞克隆出现、 扩大后根据培养液颜色的变化每3～5 d换液1次。待细胞克隆不再扩大生长时即开始传代， 加入2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA消化液， 37℃孵育6～8 min， 200 mL/L 的胎牛血清终止消化， 按1∶3的比例接种至新的培养瓶中继续培养。

　　1.2.5 脐血分离细胞的表面抗原检测 采用流式细胞术（FCM）检测: 选择P3代细胞， 抗体分别为CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC和HLADRPE。FCM检测后， 应用SystemⅡSoftware Version 3.0获取、 分析检测结果。

　　1.2.6 脐血分离细胞向神经元样细胞分化的检测 (1)RTPCR检测: P2和P10代细胞接种于6孔板， 培养达到80%以上融合后， 参照TRIzol RNA抽提试剂盒说明书抽提细胞总RNA， 按照Promega RTPCR试剂盒说明书合成细胞总cDNA（βactin作为内参照）。NSE、 NF基因片段的PCR扩增采用50 μL反应体系: 10×PCR缓冲液5 μL， dNTP 4 μL， 模板DNA（cDNA）5 μL， 上游引物（20 μmol/L）1 μL， 下游引物（20 μmol/L）1 μL， DNA聚合酶1 μL， ddh3O 33 μL。离心混匀， 94℃预变性5 min后， 按下列参数: 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 共30个循环。最后一个循环结束后72℃延伸5 min。(2)免疫细胞化学检测: 分别取P2代和P10代脐血分离细胞， 以5×106/L的密度接种于放置有消毒盖玻片的6孔板内， 每孔加入2 mL新鲜培养液， 制备细胞爬片。细胞贴壁后， 吸出培养液， 小心加入PBS轻轻冲洗2次后， 再加入40 g/L多聚甲醛室温固定15～20 min。PBS轻洗2次， 然后参照EliVisionTM Plus试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色。

　　2 结果

　　2.1 脐血分离细胞的培养和传代 原代培养的细胞刚接种时呈圆形， 48～72 h后开始有极少量细胞贴壁， 5～7 d后出现较多的贴壁细胞， 部分为成纤维细胞状的长梭形细胞和少量纺锤状细胞（图1A）。1～2 周后可见1～3个细胞克隆出现， 细胞排列成束状、 漩涡状或放射状（图1B）。2～3周左右细胞克隆不再向周围扩大， 按1∶3的比例传代后细胞扩增明显加快， 7～10 d达到90%以上融合， 为均匀一致的成纤维细胞状细胞。P2～P7代细胞增殖速度最快， 1∶3传代后3～5 d即达到90%以上融合， P8代细胞增殖速度开始变慢， P10代以后细胞增殖能力明显下降。相差显微镜下观察， P2代细胞表现为均匀一致的成纤维细胞样的形态， P3代开始偶见个别细胞表现为类似神经元的形态， 随着传代次数增加这种细胞的数量有增多的趋势。

　　图1 人脐血分离细胞的形态（×400）（略）

　　A: 培养7 d的分离细胞; B: 克隆化生长的分离细胞.

　　2.2 脐血分离细胞表面抗原的FCM检测 检测结果显示脐血分离细胞强表达CD29、 CD44、 CD105， 阳性细胞百分数分别为97.8%、 99.5%、 98.3%; 不表达CD34、 HLADR、 CD106， 阳性细胞百分数分别为0.09%、 0.82%、 0.12%（图2）。

　　2.3 脐血MSC向神经元样细胞分化的检测

　　2.3.1 RTPCR检测结果 P10代脐血MSC的RTPCR检测结果为: PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后， 在分子量100～200 bp之间出现预期的NSE、 NF的特异PCR扩增条带。P2代脐血MSC的RTPCR检测结果无NSE、 NF的PCR扩增条带。提示P10代脐血MSC有NSE、 NF mRNA表达， 而P2代脐血MSC无NSE、 NF mRNA表达（图3）。

　　图2 人脐血分离细胞的FCM检测（略）

　　图3 人脐血MSC向神经元样细胞分化的RTPCR分析（略）

　　1: 神经丝蛋白(P10); 2: 神经元特异性烯醇化酶(P10); 3: DNA marker (DL 2 000); 4: 神经丝蛋白(P2); 5: 神经元特异性烯醇化酶(P2).

　　2.3.2 免疫细胞化学检测结果 P2代细胞呈现均一的、 典型的成纤维细胞样的形态， 不表达NSE、 NF， 细胞胞质为均匀的蓝色。而P10代细胞中， 部分细胞表现为神经元样细胞的形态， 部分细胞为扁平、 宽大的形态， 均有不同程度的NSE、 NF抗原表达， 神经元样细胞胞质染成较浓的棕褐色， 而扁平、 宽大的细胞则染成浅棕色（图4）。

　　图4 人脐血MSC的免疫细胞化学检测 (×200)（略）

　　A: P10 MSC， 神经元特异性烯醇化酶 (+); B: P2 MSC， 神经元特异性烯醇化酶 (-); C: P10 MSC， 神经丝蛋白(+); D: P2 MSC， 神经丝蛋白(-).3 讨论
　　研究报道MSC在体外诱导条件下可分化为神经细胞， 诱导后MSC表现为神经细胞的形态， 并表达多种神经细胞的特异性抗原标记。而且有学者发现MSC可诱导分化为特殊类型的神经细胞， 如5HT敏感神经元［4］、 多巴胺能神经元［5］等。MSC的这种特性为其用于神经系统疾病的细胞替代治疗提供了可能， 但是对于MSC在体外诱导条件下分化为神经细胞的观点目前还存在争议。有学者认为MSC经化学诱导法诱导出现的神经元样细胞形态改变是细胞毒性损害、 胞质收缩、 细胞骨架改变的结果， 而不是真正的神经细胞［6］; 也有文献报道骨髓MSC在诱导前就已经能表达神经细胞标志物， 诱导后表达明显增加［7］。
　　
　　目前虽然对MSC的研究较多， 但还没有公认的可用来鉴定MSC的专一的、 特异性的抗原标志。主要根据细胞形态、 免疫表型、 多向分化潜能进行鉴定。MSC表达的主要抗原标志有: （1）黏附分子， CD58、 CD44等。（1）整合素家族成员， CD29、 CD51等。（3）其它分子， CD90、 CD105等。不表达造血细胞的表面抗原标志CD34、 CD45等， 不表达组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLADR抗原等， 也不表达内皮细胞表面抗原标志CD31、 CD106等［8］。本研究从足月新生儿脐血中分离培养出的MSC为均匀一致的成纤维细胞样的形态， FCM检测强表达CD44、 CD29、 CD105， 不表达CD34、 HLADR、 CD106， 符合MSCs的抗原标志特征， 提示我们分离的细胞为MSC。
　　
　　在培养过程中我们观察到脐血MSC在P8代以后增殖速度不断减慢， 而且在多次传代后少数细胞呈现类似神经元的形态， 提示MSC具有终末分化为神经元的可能。P2代细胞表现为均一的成纤维细胞样的形态， RTPCR 检测无神经元特异性抗原NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测无NSE、 NF蛋白表达， 说明这个时期的MSC中不存在神经元; 而P10代细胞则呈现不同的细胞形态， 部分细胞的形态类似于神经元， RTPCR检测有NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测也表明该类细胞能表达NSE和NF蛋白， 证明此时MSC中包含有神经元样细胞。本实验没有应用外源性诱导剂， 可以排除诱导剂对细胞形态的影响; P10代MSC不仅形态上与神经元相似， 还有神经元特异性抗原标记NSE、 NF的mRNA和蛋白表达， 进一步证实MSC有终末向神经元分化的可能。目前中胚层起源的MSC横向分化为神经细胞的确切机制尚不清楚， 基因芯片技术证实骨髓MSC不仅含有成骨细胞、 成软骨细胞、 成肌细胞等中胚层细胞的标志物基因， 还含有神经细胞的某些标志物基因， 一旦基因组中某些基因被细胞外微环境中的细胞因子所激活， 则可能向某些特定细胞分化［9］。本研究中MSC在体外培养和传代的过程中能表达NSE、 NF， 可能存在某种因素促使NSE、 NF基因激活。
　　
　　然而我们的研究结果只能说明人脐血MSC有终末向神经元分化的可能性， 是否能分化为真正的神经元还需要进一步的实验如其他神经元特异性抗原标志的检测、 电镜检查和电生理学研究， 尤其是从功能上证实这些细胞能完成某种神经活动， 如形成突触联系、 建立神经反射等。这些研究对于人脐血MSC用于神经系统疾病的细胞治疗将具有重要的理论和实用价值。

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