应用等位基因特异性PCR检测血管紧张素原基因突变

　　　　 作者：周代锋，张云霞，张勇，陈少华，李林江，习隽丽，王镇

【摘要】 目的：建立检测血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)基因2种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法：应用针对AGT基因T174M和M235T这2种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术，对海南汉、黎族人群中AGT基因突变类型进行了检测，同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果：在海南汉、黎族人群中，T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型，M235T 突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型，用等位基因特异性PCR鉴定的AGT基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好，可作为鉴定AGT基因突变类型的可行方法。

【关键词】 血管紧张素原基因;等位基因特异性;聚合酶链反应(PCR);基因分型

　　[ABSTRACT] Objective: To establish the allele specific polymerase chain reaction (ASPCR) technique for the detection of 2 normal mutations of angiotensinogen (AGT) gene. Methods: Designed ASPCR system was used to detect the mutations in Li and Han nationalities of Hainan province towards 2 common mutations of AGT gene， T174M and M235T. The sequence of the ASPCR sample was detected simultaneously. Results: Three genotypes were successfully detected in T174M mutation site which were TT， TM and MM， and 3 genotypes were successfully detected in M235T mutation site which were MM， MT and TT. All the results above provided by the ASPCR were exactly consistent with the sequencing results. Conclusion: The ASPCR with advantages of stability and simplify is an effective method for investigation of the mutations of AGT gene.

　　[KEY WORDS] Angiotensinogen (AGT) gene; Allele specific (AS); Polymerase chain reaction (PCR); Genotyping

　　肾素血管紧张素系统(reninangiotensis system，RAS)对维持血管张力和平衡血压起到了重要的调节作用，作为血管紧张素前体、唯一的肾素作用底物——血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)与心脑血管疾病的关系日益受到人们的重视。近年来研究表明，AGT基因与原发性高血压、冠心病和脑梗塞等疾病相关[1-3]。为了研究海南汉、黎族人群中AGT基因T174M和M235T的多态性，笔者建立了简便、快速检测AGT基因上述2种突变的等位基因特异性PCR技术，现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 DNA样品

　　用EDTA抗凝，从海南省海口市随机采集海南籍汉族正常人群血液样本193份，从海南省昌江和陵水等市县随机采集海南籍黎族正常人群的血液样本153份，以上样本均为血缘上的无关个体，按Lahiri等[4]方法提取DNA。

　　1.2 等位基因特异性PCR扩增AGT基因

　　1.2.1 引物的设计与合成 从Genbank中获得人类AGT基因的DNA全序列和mRNA序列，用PCR DESN软件辅助设计引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。表1 等位基因特异性PCR的引物序列及扩增片段长度

　　1.2.2 PCR扩增 每个多态位点均设立2个PCR检测管，分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应体系如下：每管在1×PCR缓冲液(10mmol/L TrisHCl，pH8.3， 50mmol/L KCl， 1.5～2.0mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2μg， 引物各0.2～0.5μmol/L， 4种dNTP各200μmol/L， Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)1U。PCR循环参数为：首先在94℃进行2min的热变性，随后进行32个循环反应(每个循环包括94℃ 50s，60℃50s，72℃60s)。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统(英国UVI tec 公司产品)中观察结果并照相。

　　1.3 AGT基因PCR扩增结果的DNA测序验证

　　随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种AGT基因型的DNA样本，将AGT1和AGT2引物对的PCR扩增特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。

　　2 结果

　　2.1 2种常见AGT基因突变位点的基因分型结果

　　每种AGT基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。

　　应用建立的等位基因特异性PCR技术对193例海南汉族人样本DNA和153例海南黎族人样本DNA进行了AGT基因的检测。在海南汉、黎族人群中，T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型，M235T突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型，见图1。

　　注：M为100bp 1与2、3与4、5与6分别为T174M突变位点TT、TM、MM基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果;7与8、9与10、11与12分别为M235T突变位点MM、MT、TT基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果。

　　2.2 AGT基因PCR扩增结果的DNA测序验证

　　测序结果表明等位基因特异性PCR技术对AGT基因的分型结果与DNA测序结果相符，说明基因分型结果的特异性和准确率均较高，见图2，3。

　　3 讨论

　　AGT基因为单拷贝基因，位于人染色体1q42-43，由5个外显子和4个内含子组成，整个基因组序列长度大约为13kb。AGT基因在多个位点上存在着多态性，近年来，AGT基因T174M和M235T多态性与冠心病、原发性高血压、急性心肌梗死和脑梗死等心脑血管疾病的相关性研究已成为国内外研究的热点[2，3，5-7]。

　　作为近年来发展起来的一项PCR技术，等位基因特异性PCR已经成为DNA点突变检测的主要技术。其原理主要依赖于DNA聚合酶对引物3′末端碱基与模板配对精确性具有较高的要求，若3′末端序列有一个碱基错配即可使PCR的扩增效率大为降低[8-10]。因此，在设计引物时可设计与正常模板引物互补的正常引物和与突变模板互补的突变引物。正常引物与突变引物绝大部分的序列相似，只有3′末端碱基有区别。若只有正常引物能扩增，则提示无相应突变。若只有突变引物扩增，则提示受检标本为突变的纯合子。若正常与突变引物都能扩增，则提示受检标本为突变的杂合子。AGT基因的突变以点突变为主，非常适合用等位基因特异性PCR技术对AGT基因的突变进行检测。目前国内主要应用PCR—RFLP连锁分析对AGT的基因突变类型进行检测[1-3，5-7]，应用等位基因特异性PCR直接检测AGT基因的突变未见文献报道。

　　本实验建立了专用于检测AGT基因T174M及M235T位点多态性的等位基因特异性PCR方法，包括用于扩增正常模板和突变模板的引物及反应条件。为使目的基因型片段得到有效扩增，在检测每一个AGT基因突变位点的两条特异性引物的3′ 末端倒数第三位均引入了一个非匹配碱基，使得引物延伸的特异性大大提高，降低了用等位基因特异性PCR检测AGT基因突变的假阳性率。此外，在全部PCR反应中同时扩增了AGT基因的一个584bp的片段作为内对照，用以判断样品DNA的完整性和PCR的质量。

　　作者应用建立的等位基因特异性PCR技术对193例海南汉族人样本DNA和153例海南黎族人样本DNA进行了AGT基因的检测，同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果表明，在海南汉、黎族人群中，T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型，M235T突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型。其基因分型结果与DNA测序结果完全相符，说明基因分型结果的特异性和准确率均较高。

　　总之，本文建立的等位基因特异性PCR技术，对AGT基因分型稳定，具有重复性好、特异性和准确率均较高的特点，为开展AGT基因的研究提供了简便、快速、准确的基因分型方法。

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