作者：周治国，刘志文，范哲意
【摘要】 精确测量细胞牵引力的大小及分布对细胞生物学、组织工程等研究具有重要意义。近年来，基于生物微机电系统技术制作的高深宽比聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微悬臂梁阵列作为细胞牵引力测量传感器受到广泛关注。不同于传统基于连续基质的测量方法，细胞在致密、垂直、离散的微悬臂梁阵列顶端贴附并延展、迁移，引起微悬臂梁形变。通过对扫描电子显微镜图像处理，细胞牵引力测量精度可以达到数十 nN/m。我们综述了基于微悬臂梁阵列细胞牵引力传感器测量方法，重点论述了实验原理、制作工艺和细胞实验，并讨论了微悬臂梁阵列结构倒塌机理。
【关键词】 细胞牵引力；生物微机电系统；聚二甲基硅氧烷；微悬臂梁阵列；图像处理
Abstract：Cell traction forces (CTFs) precision measurement is significant for many research fields such as cell biology and tissue engineering and so on. In recent years， enabled by the advancement in the Biological Micro Electromechanical Systems (BioMEMS) technology， high-aspect-ratio polydimethylsiloxane (PDMS) microcantilever array devices which serve as CTFs sensors have been widely concerned. Rather than conventional continuous substrates， cell attached and spread across multiple discrete vertical microcantilevers， and bent the microcantilevers. By processing scanning electron microscope (SEM) images，the resolution of the CTFs can reach tens nN/m scale. Here a review of microcantilever array method for CTFs measurement is presented. The measurement principle， fabrication processes， and cell experiments are discussed in detail. Furthermore， structure collapse mechanism is mentioned.
Key words：Cell traction force;Biological micro electromechanical systems;Polydimethylsiloxane;Microcantilever array; Image processing
1 引 言
细胞通过焦点粘附传递纳牛顿量级牵引力到底层基材［1］。细胞牵引力在细胞迁移和细胞形态保持中起关键作用，在许多生物学过程中扮演了基础角色，比如新生血管生成，胚胎形成，炎症和伤口愈合等。过去几十年来，许多方法用来在亚细胞层面测量细胞牵引力。根据引起细胞形变所采用的技术可以分为两大类：主动方法和被动方法。主动方法使用外力使细胞产生形变来测量细胞牵引力，其中有原子力显微镜方法［2］和微吸管方法［3］；被动方法采用传感器来被动探测细胞产生的力，包括弹性基材法［4］和微珠栅格图案法［5-6］。原子力显微镜法利用固定在柔性悬臂梁上的探针来探测细胞，可以观测细胞和探针的相对形变，以计算施加于细胞上的力大小和细胞硬度。这种方法的缺点是测量探针容易破坏细胞。微吸管法用微吸管吮吸细胞，由于真空吸力使细胞产生形变。施加的力可以通过形变量计算得出，细胞的机械特性也可以由测量到的数据推算得出。弹性基材法通过人造柔性基材来测量单个细胞的牵引力。当细胞贴附、迁移时，将产生牵引力并会对硅树脂基材拉扯，通过观测基材所造成的皱折形变来测量细胞的力学行为。这种方法存在许多测量技术上的限制，当力作用在相同平面基材的不同方向上时，会使标定物在连续平面上的位移互相抵消产生测量错误。微珠栅格图案法是为了改善可皱折式基材测量的缺点而发展起来的，测量原理主要是在硅树脂基材嵌入微珠作为基材形变的标定物，通过显微镜观测微珠的位移进而测量出细胞牵引力。
随着BioMEMS 技术的进步，近年来经过表面处理高深宽比 PDMS 微悬臂梁阵列被开发出来作为传感器，用来探测细胞牵引力及在体外研究细胞的机械性质［7-10］。采用微加工工艺在硅片上制作模具，复脱模法制作 PDMS 微悬臂梁阵列。细胞贴附在微悬臂梁阵列顶端，在多个微悬臂梁顶端间延展迁移，该过程会造成微悬臂梁阵列发生弯曲形变。采用这种致密、垂直、离散微悬臂梁阵列结构替代传统连续测量介质，在基材面上，每个接触到细胞的微悬臂梁作为独立的力学传感器单元来测量细胞牵引力，通过对微悬臂梁阵列形变的显微图像处理，细胞牵引力可以被直接定性、定量测量，精度可以达到数十 nN/μm。
2 测量原理
图1是细胞在微悬臂梁阵列顶端贴附、延展及微悬臂梁形变示意图。微悬臂梁在小形变范围内形变可视作线性弹性形变，形变量正比于细胞牵引力。根据线性弹性理论［11］，圆柱体微悬臂梁半径r，高度L，在外力F作用下弯曲产生形变，具体公式如下，其中E，K和Δx， 分别为杨氏模量，弹性常数和形变量。
F=KΔx=(3πEr44L1)Δx(1)
3 PDMS微悬臂梁阵列制作过程
图2展示了采用复脱模方法制作微悬臂梁阵列的关键步骤。
3.1 第一步 (图2 A-C) 是将设计好的掩模图案通过光刻工艺转移到光刻胶上。Tan 等［7］采用 SU-8 (Microchem， Newton， MA) 负光胶，紫外曝光及显影后，直径 3 μm、高度11 μm、间距 9 μm的 SU-8 垂直悬臂梁阵列竖立在硅片上，作为复脱模微模具。由于光波长限制、毁坏性粘着及光胶回流等原因，采用接触 I-line (波长365 nm) 紫外软光刻标准工艺制作尺寸更小的结构非常困难。du Roure等［8］and Li等［9］采用正光胶和深反应离子刻蚀 (DRIE) 工艺，在硅片上刻蚀出圆柱形孔阵列。采用这种工艺，du Roure 等制作出直径 1 μm、高度 5.2 μm、间距 3 μm的微悬臂梁阵列，这些尺寸指标非常突出。然而该方法有两个缺点，首先，深反应离子刻蚀工艺对设备条件要求很高，对大部分研究人员而言，工艺制作费用非常昂贵；其次，用这种方法制作的微悬臂梁不完全是圆柱体，而在理论分析中一般采用圆柱体模型，若不经校正直接使用，会导致测量误差。Addae等［10］通过消除 SU-8 和掩模之间空气间隙的不利影响，改进了接触 I-line 紫外软光刻和 SU-8 负光胶的制作工艺，制作出更精细的结构。
3.2 第二步 (图 2D-G) 是 PDMS 预聚物浇注，其中采用负光胶工艺需要二次浇注。首先，准备 PDMS (Sylgard 184， Dow-Corning)预聚物，充分混合PDMS 及其固化剂 (体积比: 10∶1) ，置入真空泵中抽气20 min，PDMS 预聚物浇注到硅片上的 SU-8 悬臂梁阵列微模具上，放置在热板上，65 ℃烘烤 12 h，将 PDMS 微模具从硅片剥离，氧离子处理 1 min，脱模剂蒸熏 12 h，以利于后续 PDMS 微悬臂梁阵列从 PDMS 微模具上分离。 然后，将PDMS 预聚物浇注到 PDMS 微模具中，置入真空泵抽气 20 min，110 ℃烘烤20 h，从 PDMS 模上剥离 PDMS 微悬臂梁阵列。对于采用 DRIE 工艺直接硅片刻蚀生成的微模具，硅片先经过硅烷化处理以易于后期脱模，然后将PDMS 预聚物浇注到硅片微模具，65℃烘烤 12 h，从硅模上剥离。
3.3 第三步 (图2 H-I) 是微悬臂梁顶端表面处理。PDMS 微悬臂梁阵列脱模后，氧离子表面处理使其亲水。为进行下一步细胞实验，采用微接触印刷方法［12］ ，在PDMS 微悬臂梁阵列预定区域印刷上经过荧光标记的细胞外基质蛋白质。Addae等［10］采用量子点标记技术可以在标准荧光显微镜下跟踪微悬臂梁形变得到更精确的位移信息，使微分干涉差显微镜产生的悬臂梁顶端和细胞边缘模糊问题最小化，并消除了信号衰减的时间依赖性。
力测量实验的扫描电子显微镜 (SEM) 照片，采用同一标尺合成在一起以便于比较。Tan 等设计了 mPADs (microfabricated post-array-detectors)，直径 3 μm、高度 11 μm、间距 9 μm，相对应每根悬臂梁可以达到 32 nN/μm 精度［7］。采用 DRIE 方法，du Roure 等制作出 μFSA (microdimensional force sensor array) ，直径 1 μm、高度 5.2 μm、间距 3 μm，深宽比接近 6，这是目前采用 PDMS 微悬臂梁阵列方法测量细胞牵引力所报道的最高深宽比值，力学测量精度可以达到 21.8nN/μm［8］。MFSA (micropost force sensor array) 由Li 等开发，直径 2 μm、高度 6 μm、间距 4 μm，深宽比为3。结合图像处理算法，MFSA 可以达到 40 nm 分辨率和 0.5 nN 力学灵敏度［9］。BoN (bed of nails) 由 Addae-Mensah等研制，直径 2 μm、高度 7 μm、间距 5 μm，深宽比为 3.5，据报道精度可以达到13.6 nN/μm［10］。
4 讨论
根据公式 (1) ，更高深宽比的微悬臂梁可以带来更高的力学分辨率。实际上研究者们已经尝试提高工艺水平来制作更高深宽比的微悬臂梁阵列。比如直径 1 μm，高度 20 μm，深宽比为 20 的微悬臂梁，当 PDMS 杨氏模量为 2 MPa 时，理论上对应精度为 0.04 nN/μm。如此高的力学分辨率确实不错，但直觉告诉我们，过高的深宽比结构会造成机械稳定性问题。文献［13-15］ 显示几何结构一致的高深宽比 PDMS 悬臂梁会造成机械稳定性问题，如侧面倒塌和触底倒塌。侧面倒塌指多个微悬臂梁倒塌导致互相之间粘连，触底倒塌指单个微悬臂梁倒塌与基底之间粘连。基于 Hui 的倒塌模型理论［16］，高深宽比结构倒塌是由于自身重量所引起。但根据重力引起倒塌理论，目前尺寸条件下所有制作的 PDMS 微悬臂梁都不应该有稳定性问题，但实验结果事与愿违。文献［17］指出，由于 PDMS 杨氏模量限制，在空气中 PDMS 微悬臂梁的临界深宽比在 6 左右。即使增加 PDMS 预聚体的烘烤时间或改变 PDMS 与固化剂的混合比率，杨氏模量不会发生显著改变［18］。
我们发现在溶液中，PDMS微悬臂梁临界深宽比可以提高。实际上，在细胞实验中，粘附有细胞的微悬臂梁是浸没在培养基溶液中。因此，我们可以在溶液环境中制作微悬臂梁阵列以提高深宽比。我们设计了实验在溶液环境下制作微悬臂梁阵列并将其浸没在不同的溶液中，如乙醇和水中来考察其机械稳定性。实验表明，如果我们可以避免液体蒸发，打破微悬臂梁顶端液体表面张力平衡，微悬臂梁阵列可以保持直立稳定。溶液表面能越低，临界深宽比就越高，在水溶液中可以得到深宽比为 10 左右的微悬臂梁阵列。即使一些未知扰动，如碰撞，流体表面张力等，不会导致微悬臂梁粘连倒塌。
5 结论
细胞牵引力细节知识对理解生物过程有着重要意义已成为共识。采用经过表面处理的高深宽比 PDMS 微悬臂梁阵列作为传感器，用来探测细胞牵引力，可以得到数十 nN/m 的分辨率。我们详尽地综述了采用 BioMEMS 工艺制作 PDMS 微悬臂梁矩阵的方法。对测量原理和模型，制作技术流程，表面处理，细胞实验等逐一详细论述。BioMEMS 制造工艺发展迅速，虽然还有很多不足之处需要我们去完善，但其为细胞力学测量领域提供了非常多的机会和方法值得我们去探索。
本工作由国家留学基金委支持，作者在此感谢北京理工大学生命信息实验室和美国哥伦比亚大学生物微机电系统和微流控实验室人员的帮助。
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