小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)FGFR1的构建及表达

　　　　　　 作者：郭峻莉，翁志宏，郑少江

【摘要】 目的：通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)FGFR1，并检测其在CHO细胞中的表达。方法: 通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA， 应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒， 经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后， 用脂质体包裹转染CHO细胞，Western blot 检测FGFR1目的蛋白的表达。结果：经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确， 该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论：成功构建的pcDNA3.1(+)FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。

【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子1型受体(FGFR1);真核表达质粒;基因工程

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　　[ABSTRACT] Objective: To construct a recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+)FGFR1， and detect its expression in the cell of CHO. Methods: The fulllength gene of murine FGFR1 was amplificated by PCR， and then was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+). After the recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysed and sequencing test， it was transfected into eukaryotic cell CHO by lipofectin. The FGFR1 protein was explored by Western blot. Results: The constructed recombinant plasmid contained the sequence of FGFR1 gene. After transfection with the plasmid， FGFR1 protein can be expressed in CHO cells. Conclusion: The constructed eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+)FGFR1 can effectively express FGFR1 protein in vitro.

　　[KEY WORDS] Fibroblast growth factor receptor1 (FGFR1); Eukaryotic expression plasmid; Genetic engineering

　　现已证实，实体肿瘤的生长与转移必须依赖于血管生成[1，2]。碱性成纤维细胞生长因子1型受体(fibroblast growth factor receptor1，FGFR1)是最重要的肿瘤血管生成调节因子之一，其主要通过与高亲和性配体bFGF结合后发生二聚体化导致自身磷酸化，从而诱导肿瘤血管生成，进而促使肿瘤细胞增生和转移[3-5]。 可见，FGFR1/bFGF信号传导通路在肿瘤血管生成中扮演着重要作用。许多研究表明，利用DNA核酸疫苗可以诱导产生交叉免疫反应抗肿瘤血管生成[6-8]。我们新近研究也证实，以FGFR1基因为靶点的生物治疗可以抑制肿瘤血管生成达到治疗肿瘤的目的[9-11]。因此，本研究拟利用基因工程技术构建小鼠FGFR1真核表达载体，为后继研究FGFR1的医学应用奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 质粒和宿主菌 真核表达质粒pcDNA 3.1 (+) 购自 Invitrogen公司，宿主大肠埃希杆菌E. coli DH5α和CHO 细胞株为本实验室保存。

　　1.1.2 酶类及试剂 Trizol、转染试剂盒LipofectamineTM2000 购自Invitrogen 公司，一步法RTPCR试剂盒、DNA marker、限制性内切酶和T4 噬菌体DNA 连接酶购自TaKaRa公司，胎牛血清购自Gibcol 公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG 购自Santa Cruz 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因片段的体外扩增 根据GenBank中小鼠FGFR1基因全序列设计扩增其全长基因序列的引物。 经引物设计软件Oligo6.0评价，设计的引物符合要求，没有破坏FGFR1基因的阅读框架。上游引物：5′ATA TGT GGG GAT GGA AGT GCC TC 3′，下游引物：5′AAT CAG CGC CGT TTG AGT CCA C 3′，引物由上海基康生物技术有限公司合成。在上、下游引物的5′端分别加入限制性核酸内切酶Bam HI 和 XhoI酶切位点。在梯度PCR仪上进行扩增，获得小鼠FGFR1全长基因片段(产物为2201 bp)。PCR条件为：94℃预变性1min，94℃变性30s， 55℃退火1min， 72℃延伸3min， 共28个循环， 最后72℃延伸10min，4℃保存PCR产物，取2～5μL进行琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.2 重组表达载体 pcDNA3.1(+)FGFR1的构建及酶切鉴定 用Bam HI 和 XhoI 双酶切 PCR 纯化回收产物及载体pcDNA 3.1 (+)，在离心管内加入T4 DNA 连接酶于16℃水浴中连接过夜。连接产物转化感受态DH5α 大肠埃希杆菌， 于选择性LB 固体培养基(含100μg/mL 氨苄青霉素) 上生长。抽提阳性克隆的重组质粒， 进行Bam HI 和 XhoI 双酶切，以琼脂糖凝胶电泳鉴定。用PCR筛选阳性转化子。重组子插入片段的序列测定由上海英骏公司协助完成。

　　1.2.3 重组质粒的转染 将CHO细胞接种于6孔板中，在细胞达到80%的融合时开始转染。取2μg 质粒DNA 和10μL LipofectamineTM2000，分别用100μL无抗生素、无血清DMEM培养液稀释;静置5min后将两者混匀，室温孵育30min， 以便脂质体充分包裹质粒。然后加1mL 无血清的DMEM培养液加入此复合体中，混匀后小心滴加到CHO细胞上，37℃、5% CO2 培养箱中培养8～14h，再向每孔中加入2mL 含10%DMEM的完全培养液，继续培养48h 后收获细胞或上清液。

　　1.2.4 Western blot 检测FGFR1的表达 提取总蛋白并纯化， 纯化后的蛋白按照文献[9]行Western blot分析， 用antiFGFR1 抗体(1∶500 稀释)室温孵育1h，然后TBST洗膜3次，每次10min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶3000 稀释)孵育1h，然后TBST 洗膜3次，每次10min，ECL 显影， 观察杂交条带。

　　2 结果

　　2.1 RTPCR扩增目的片段的分子量鉴定

　　以小鼠的FGFR1为模板设计上游引物和下游引物，通过 PCR 进行扩增后将产物进行琼脂糖凝胶电泳得到2201bp左右目的片段，与预期大小完全相符(图 1)。

　　2.2 重组质粒的构建、酶切鉴定和测序鉴定

　　重组质粒用Bam HI和XhoI进行双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳显示2条带，分别为约5400bp的pcDNA 3.1 (+)的线性片断和2201bp的插入基因片断(图2) ，与预计相符合。重组质粒送上海英骏公司测序，测序结果显示重组质粒pcDNA3.1(+)–FGFR1中插入的FGFR1序列与GenBank上小鼠的FGFR1编码区序列完全一致。

　　2.3 重组真核表达质粒在CHO细胞中的表达

　　ECL显色后可见预期大小(130 kDa)的特异性条带 (图3， 泳道1 )，说明重组表达质粒转染的CHO细胞中有FGFR1目的蛋白的表达;而转染pcDNA3.1(+)空质粒的CHO细胞未检测到 FGFR1目的蛋白(图3， 泳道2)。

　　3 讨论

　　研究表明，血管生成在实体肿瘤的生长与转移中扮演重要作用[1，2]。FGFR1是一种跨膜蛋白质，在肿瘤新生血管内皮细胞中高表达，主要通过与配体bFGF结合发挥其生物活性，诱导肿瘤血管生成[3]。研究表明，bFGF/FGFR1传导通路在肿瘤新生血管的生成过程中起重要作用[3-5]。可见，干扰或阻断bFGF/FGFR1信号通路来抑制肿瘤细胞的增生和(/或)抑制肿瘤组织内血管生成可能是肿瘤生物治疗的一种有效策略。许多研究表明，利用异种同源DNA作为疫苗可以抑制肿瘤血管生成进而达到治疗肿瘤的目的[6-8]。此外，我们前期实验也发现针对肿瘤血管生成靶分子FGFR1的生物治疗可以有效抑制肿瘤血管生成，达到治疗肿瘤的目的[9-11]。因此，以FGFR1为靶向的抗血管生成主动免疫的方法展现了更好的应用前景，如果我们能够获得FGFR1 真核表达载体，就有可能应用于后续抗肿瘤血管生成治疗研究。

　　本实验成功构建了小鼠FGFR1重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)–FGFR1，应用细胞转染技术将其导入CHO真核细胞中，Western blot 证实所构建的重组pcDNA3.1(+)–FGFR1 质粒可以有效表达小鼠FGFR1目的蛋白，实验结果将为下一步以FGFR1为靶点的抗肿瘤血管生成治疗奠定基础。

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