作者：张雪，张风河，李纾，吴修胤
【摘要】 探讨乳大鼠肌源性干细胞的体外培养及纯化分离方法。采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化乳大鼠骨骼肌，网孔过滤纯化肌源性干细胞后，通过体外原代和传代培养，经生长曲线、细胞融合率等指标研究肌源性干细胞的增殖和分化能力，免疫细胞化学染色法进行鉴定。结果表明：通过上述方法分离得到小圆形或短梭形的细胞，免疫细胞化学染色desmin及CD34为阳性。说明网孔过滤法可提高肌源性干细胞的纯度。
【关键词】 肌源性干细胞；微孔尼龙网；体外培养；分离纯化；细胞传代
Abstract：To establish the methods for culture，purification and segregation of rat muscle-derived stem cells in vitro.By two-step method， the rat muscle was digested with type Ⅺ collagen and trypsin，and the isolated cell suspension was purified by the millipore nylon net filter. The proliferation ability of MDSCs were analyzed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunocytochemical technique.The results showed that the isolated MDSCs were small-cycloid or short-fusiform-shaped. They showed desmin(+) and CD34(+) by cell immunocytochemical technique. It proves that the method can improve the purification of the MDSCs through the millipore nylon net filters.
Key words：Muscle derived stem cells; Millipore nylon net; Culture in vitro;Purification and segregation;Passage
1 引 言
近年在骨骼肌中发现了一群被称为肌源性干细胞（muscle-derived stem cells， MDSCs）的细胞群体，它具有良好的自我更新和增值能力及多项分化潜能，在适当的环境条件中可分化为骨骼肌细胞、血细胞、成骨细胞、内皮细胞、神经细胞［1-2］等。因此，在细胞分子生物学研究中培养高纯度的肌源性干细胞非常重要。
2 材料和方法
2.1 材料和试剂
新生Wistar大鼠20只，购自山东大学西校区动物中心。Ⅺ型胶原酶、多聚赖氨酸(Sigma公司)；Dispase (Gibco公司)、胰酶(Hyclone公司)、DMEM培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(杭州赛乐公司)、马血清(Hyclone公司)、小鼠抗大鼠desmin、SABC试剂盒及DAB试剂盒购于武汉博士德公司。微孔尼龙过滤网11 um，20 um，30 um，41 um。
2.2 骨骼肌细胞的消化
选择健康的新生(3天以内)Wistar大鼠，将其置于75%酒精中5 min，无菌条件下切取其四肢肌肉，在外科显微镜下剔除肌肉表面筋膜及血管，含抗生素液的D-Hanks液冲洗3次（抗生素液为：青霉素1 000 U/ml、链霉素1 000 U/ml），移入培养皿中，用显微外科剪标本为0.5 mm3左右的小块，移入离心管中，加入培养液，静止3 min，去掉上层漂浮组织，0.1%Ⅺ型胶原酶消化30 min，加DMEM培养液离心（1 000转/min）3次，弃上清。0.25%胰蛋白酶消化1 h，加含20%胎牛血清的培养液终止消化，依次滤过100目、200目、400目不锈钢网，滤液离心5 min（1 000转/min），分别用含20%胎牛血清（生长培养基）和2％胎牛血清（分化培养基）的培养液重新悬浮细胞PP0。
2.3 网孔过滤法进行分离纯化
2.3.1 过滤细胞 将圆形过滤网对折两次，打开呈漏斗状，距离圆周边缘5～10 mm，将滤网三折处用U形钉固定，95%酒精至少浸泡2～3 h，过滤细胞之前将过滤网上的酒精挥发或用PBS将其冲洗干净。滤网置于50 ml的锥形管上，并放置于50 ml的离心管。配置细胞悬液:将酶消化后的细胞悬液PP0制成单位悬液，1U=(3-5)×106cells/10ml。用移液管将细胞悬液移入，移液管尖部位于离心管与锥形管接触点的下方。开始滴加细胞悬液时，要缓慢地将细胞悬液滴入漏斗底部，2～3滴/s，因重力细胞悬液通过滤网。随着大部分细胞悬液的通过，过滤速度越来越慢，为了使尽可能多的细胞顺利通过，用钳状骨针提起滤网边缘并轻轻振动，加快剩余细胞悬液的滤过。
2.3.2 收集细胞 去除U型钉，打开滤网，通过强烈的振动，将未通过滤网的细胞尽可能多的释放于组织培养基中。收集每一次细胞悬液通过滤网后的残留细胞。最后，用无菌钳状骨针将滤网底部提起，无菌剪刀将未接触细胞悬液的滤网剪掉，剩余滤网放置于含有30～40 ml新鲜培养基的50 ml锥形管中，充分振动使细胞与滤网分离。将所有分离细胞移入培养皿中继续培养，传代，鉴定。
2.4 细胞生长曲线测定
将第2代细胞分别制备单细胞悬，分别消化后，以104/孔接种于24孔培养板中。每组每天取3孔消化后，进行细胞记数，共7天。根据记数结果绘制细胞生长曲线。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘在坐标纸上。
2.5 细胞融合情况的观察
取生长状态良好的第2代骨骼肌源性干细胞，分别消化后，以105/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基进行培养。共14孔，每7孔为一组。待细胞分裂、增殖至80％汇合后，一组加入生长培养基（含20%FBS的DMEM），另一组加入分化培养基（含2%FBS的DMEM）继续培养。每天各组取一孔，将盖玻片进行 HE 染色后，光镜下观察细胞形态的动态变化，计算细胞融合率 （细胞融合率=融合到多核细胞内的细胞核数 / 总细胞核数）。
2.6 免疫细胞化学法鉴定
收集第2代细胞球，在预先包被L-多聚赖氨酸的盖玻片上作涂片，按试剂盒方法分别进行desmin、CD34荧光免疫法试验。显微镜下观察，照相。
3 结果
3.1 细胞形态
MDSCs原代培养的肌源性干细胞依次通过11 um、20 um、30 um、41 um的滤网过滤后，刚开始贴壁时细胞形态为圆球形，完全贴壁后细胞形态呈纺锤形、梭形(见图1)；传代培养的肌源性干细胞呈不规则形(见图2)。
3.2 细胞生长曲线
自第2天开始，细胞就进入对数生长期，第5天后由于接触抑制，增殖速度减慢，逐步达到平台期（见图3）。
3.3 细胞融合情况的观察
MDSCs在分化培养基作用下，细胞间发生融合、形成肌管的能力明显增强（见表1）。肌管为光滑长表1 不同培养条件下MDSCs的融合率（％）注：*与生长培养基组比较，有显著性差异（P＜0.01）条形，许多细胞核聚集在一起，位于肌管的中央，形成核链，肌管间多呈平行排列（见图4）。
3.4 细胞鉴定
免疫细胞化学显示，结蛋白（desmin）及CD34在骨骼肌源干细胞中呈阳性表达（见图5）。
4 讨 论
MDSCs是近年来研究的热点，实验研究方法也是目前科研人员讨论的重点。
正常情况下，MDSCs在肌肉中数量很少，不论采用差速贴壁法［3］、梯度离心法，还是流式细胞仪，细胞分离过程中都会对本身就很少的MDSCs进一步造成损失。本实验将细胞悬液PP0通过四种直径不同的尼龙微孔过滤网过滤，可将直径小的细胞过滤分离出来，然后再进行培养，得到纯度较高的MDSCs。这种实验方法是利用MDSCs直径较大，以及微重力原理进行的，另外此试验操作较为简单，得到的细胞具有较高的数量和质量，对细胞本身形态及特性的损伤非常小。
肌管形成是MDSCs分化的标志，除形态上的变化外，部分骨骼肌特异性蛋白的合成与表达也是分化的重要标志，可将此作为MDSCs的鉴定指标。结蛋白desmin是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分之一，是较早表达的肌源性标志蛋白，是目前公认的成肌分化的早期标志物［4］，在MDSCs中，desmin阳性率可达90％，由此可以进行初步鉴别。另一个潜在的鉴定肌源性干细胞的标记物是CD34［5］，研究认为CD34的表达限于毛细血管内皮细胞、造血前体细胞和骨髓中的间质细胞前体，被确定为干细胞的标记物。
MDSCs来源广泛，取材方便，容易分离培养和体外扩充增殖且易于外源基因的导入和表达，使用安全，自体移植又克服了伦理学争议和排斥反应等问题，将为临床众多疾病包括骨缺损修复、肌萎缩、心肌梗死、压力性尿失禁等的治疗带来新的希望，还可为基因治疗神经系统的疾病提供良好的载体，是组织工程临床用于脊髓损伤修复的理想种子［6-7］。本实验在以往实验的基础上，通过微孔过滤法获得纯度较高的MDSCs，为种子细胞的广泛应用提供了良好的条件。
参考文献
［1］Sarig R， Baruchi Z， et al. Regeneration and transdifferentiation potential of muscle-derived stem cells propagated as myospheres［J］. Stem Cells，2006，24(7):1769-1778.
［2］Hans R， Popa V， Murry CE， et al. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting ［J］. Mol Cell Cardiol， 2002， 34: 241-249.
［3］Jankowski RJ， Haluszczak C， Trucco M， et al. Flow cytometric characterization of myogenic cell population obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem- cells ［J］. Hum Gene Ther，2001，12 (6):619-628.
［4］Hwang JH， Yuk SH， Lee JH， et al. Differentiation of stem cells isolated from rat smooth muscle［J］. Mol Cells， 2004， 17:381.
［5］Deasy BM， Gharaibeh BM， Pollett JB， et al. Long-term self-re-newel of postnatal muscle-derived stem cells［J］. Mol Biol Cell， 2005， 16 (7): 3323-3333.
［6］Arsic N， Mamaeva D. Lamb NJ， Fermandez A， et al. Muscle-derived stem cells isolated as non-adherent population give rise to cardiac， skeletal muscle and neural lineages ［J］. Exp Cell Res， 2008， 314(6):1266-1280.
［7］Lee JY，Cannon TW，Pruchnic R，et a1．The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence［J］. Int Urogynecol，2003，14：31-37．