作者：李春燕，李连博，祝建平，崔希云，艾洪滨
【摘要】 探索石榴皮水提物对十二指肠段收缩运动的作用及其机制。分别用0.1、0.5、1、5 mg/ml 4种不同浓度的石榴皮水提物、吗丁啉、吗丁啉与石榴皮水提物混合液、新斯的明、新斯的明与石榴皮水提物混合液作用于大鼠离体十二指肠段，记录给药前第2 min和给药后第2、5、10 min十二指肠段的收缩曲线，比较给药前后收缩波的频率和幅度的变化。与给药前比较，0.5、1、5 mg/ml 3种不同浓度的石榴皮水提物对十二指肠段的收缩频率均有明显的抑制作用(P&<0.05)，0.1 mg/ml组作用不显著(P&>0.05)。除5 mg/ml 组在给药后第10 min的收缩幅度小于给药前(P&<0.05)外，其他各组对收缩幅度的影响均不显著(P&>0.05)。石榴皮水提物可明显地阻断新斯的明诱导的十二指肠段持续性收缩;对吗丁啉诱导的收缩加强作用表现为协同效应。0.5～5 mg/ml 的石榴皮水提物对十二指肠段的收缩频率均有明显的抑制作用，这种抑制作用可能是通过影响乙酰胆碱作用通路实现的。
【关键词】 石榴皮水提物;十二指肠运动;吗丁啉;新斯的明;大鼠
Abstract：To observe the effects of water-soluble extraction from pomegranate peel on the motility of isolated duodenum segments in rats and its action pathways.The animals were pided into different administration groups. The groups were water extractions from Pomegranate Peel (0.1 mg/ml， 0.5 mg/ml， 1 mg/ml， 5 mg/ml)， domperidone， domperidone and aqueous extract of Pomegranate peel mixed solution， neotigmine， neotigmine and aqueous extract of Pomegranate peel mixed solution. The contractive curve of isolated duodenum of rat was recorded 10 min before and 10 min after drugs administration. The frequency and amplitude of contraction wave were analyzed in the second minute before and the second， fifth， tenth minute after drugs administration.0.5，1，5 mg/ml aqueous extract of Pomegranate peel could significantly reduce the contraction frequency of duodenum segment (P&<0.05) by compared after with the before drugs administration， 0.1mg/ml aqueous extract of Pomegranate peel also could reduce the frequency， but have no statistically significant (P&>0.05). All concentrations of aqueous extract of Pomegranate peel couldn′t influence amplitude other than 5 mg/ml in the tenth minute significantly (P&<0.05). Aqueous extract of Pomegranate peel could interrupt durative constriction induced by neotigmine significantly. However， it was intensifying in constriction induced by Domperidone. It may be a synergistic action. The results show that 0.5～5 mg/ml aqueous extract of Pomegranate peel have prominent inhibitory effect on the contraction frequency of duodenum segment and this effect may be operated by acetylcholine pathway.
Key words：Aqueous extract of Pomegranate peel;Duodenum motility;Domperidone;Neotigmine;Rat
1 引 言
石榴(Punica granatum L)属于石榴科，石榴属，落叶灌木或小乔木，石榴皮是石榴的干燥果皮，内含鞣质、黄酮、原花青素等，性酸、味涩，具有涩肠、止血、杀虫之功效[1]。石榴皮煎汁服用，为中医治疗各型腹泻的经验效方[2]，临床应用广泛，提示石榴皮中含有治疗胃肠运动异常的有效物质。动物实验表明，石榴皮的甲醇提取物可降低由阿司匹林和乙醇导致的胃溃疡发生率[3]。程会昌[4]等人通过研究石榴皮提取物对家兔离体十二指肠、空肠和回肠运动的影响，指出石榴皮提取物对其有抑制作用，可降低肠管平滑肌收缩张力，使收缩频率减小。大鼠是常用的药理实验动物，石榴皮水提物对大鼠十二指肠的作用及其机制未见报道。为探明石榴皮水提物对胃肠运动的影响及其机制，了解其作用的靶点，我们通过观察不同浓度石榴皮水提物对大鼠离体十二指肠收缩运动的影响，并对其作用机制进行了初步的探究，为石榴皮水提物对消化道疾病的临床治疗提供动物实验依据。
2 材料与方法
2.1 实验动物
Wistar大鼠(普通级)，雄性，200～250 g。山东大学实验动物中心提供。
2.2 实验仪器
BL-410生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，扫描速度16.00 s/p、增益 G=200、时间常数 T=DC、高频滤波F=30 KHz 。张力换能器(高碑店市新航机电设备有限公司，JZ100型)， 平滑肌离体灌流恒温装置(上海市实验仪器厂)。
2.3 实验方法
大鼠实验前禁食24 h，自由饮水，颈椎脱臼法处死[5]，立即剖开腹腔，沿胃幽门向下剪取约1 cm左右的十二指肠段，用37℃台氏液将其洗净，用细线结扎其两端，放入恒温浴槽中心管内，肠管的下端系于L管挂钩上，上端与张力换能器相连。输入BL-410生物机能实验系统。稳定10～15 min后，开始实验。
待十二指肠收缩状态稳定后，先记录10 min的正常收缩曲线。然后分别用0.1、0.5、1.0、5.0 mg/ml的石榴皮水提物溶液(台氏液配制)，吗丁啉(20 μg/ml)，吗丁啉(20 μg/ml)+石榴皮水提物(1 mg/ml)，新斯的明(10 μg/ml)，新斯的明(10 μg/ml)+石榴皮水提物(1 mg/ml)溶液替换浴槽中的台氏液，记录给药后10 min十二指肠的收缩曲线，然后放掉，用台氏液冲洗三次。等十二指肠运动曲线稳定后，进行下一步实验。每种药品在每只动物均进行3次重复实验。
2.4 实验数据的处理
本研究以描记曲线离开基线上升达峰顶后下降回到基线的过程作为一次收缩，峰顶和基线之间的幅度即为该收缩波的收缩幅度，完成一次收缩所用的时间为收缩时程，本文仅统计收缩幅度大于等于0.01 g的收缩波。统计加药前第2 min、加药后第2 min(这一段的起点以加药后曲线基本回到基线时为准，以排除刚加药物对十二指肠的刺激造成的不规律收缩，一般在1 min左右)、第5 min、第10 min内(1 min时间内)十二指肠的收缩波的频率、幅度。每只动物在每个时间段的变量是三次重复实验的均数。用SPSS 13.0(SPSS Inc. Chicago， Ill.， USA)统计软件计算变量的平均值和标准差，数据采用自身配对t检验，比较给药前、后的差异，以P≤0.05为差异显著，以P≤0.01为差异极显著。
3 实验结果
3.1 不同浓度的石榴皮水提物对十二指肠收缩
频率的影响 不同浓度的石榴皮水提物均使十二指肠的收缩频率呈现出不同程度的下降，其中，0.5、1、5 mg/ml剂量组给药后的第2 min时十二指肠的收缩频率与给药前即显著降低(P&<0.05)，到给药后第10 min时，1、5 mg/ml剂量组的收缩频率与给药前相比出现极显著降低(P&<0.01)。0.1 mg/ml剂量组的收缩频率在给药后虽有所降低，但与给药前相比差异不显著(P&>0.05)。见表1。表1 不同浓度的石榴皮水提物对十二指肠收缩频率注：*表示P&<0.05，**表示P&<0.01
3.2 不同浓度的石榴皮水提物对十二指肠收缩
幅度的影响 由表2可见，0.1、0.5、1 mg/ml剂量组的石榴皮水提物对十二指肠收缩幅度的影响，给药前和给药后不同时间相比较，差异均不显著，只有5 mg/ml组在给药后第10 min时显著减小(见图1)。
3.3 不同药物对十二指肠收缩频率的影响表2 不同浓度的石榴皮水提物对十二指肠收缩幅度(g)的影响注：*表示P&<0.05
由图2可见，吗丁啉、吗丁啉与石榴皮的混合液均可使十二指肠的收缩频率减低，且出现的时间规律相同，抑制作用相近的现象。提示石榴皮水提物对吗丁啉诱导的十二指肠收缩频率降低无改善作用。新斯的明、新斯的明与石榴皮混合液也都使十二指肠收缩频率下降，但出现的时间、强度却有差异。提示石榴皮水提物对新斯的明诱导的十二指肠收缩频率下降有影响。
3.4 不同药物对十二指肠收缩幅度(g)的影响
由图2可见，与给药前比较，吗丁啉、吗丁啉与石榴皮的混合液均可使十二指肠的收缩幅度增大。新斯的明、新斯的明与石榴皮混合液也都使十二指肠收缩幅度下降，但出现的方式、时间、强度却有差异。新斯的明诱导十二指肠持续性收缩(见图2)，基线抬高;新斯的明与石榴皮混合液使十二指肠舒张，基线下降(见图2)。提示石榴皮水提物对新斯的明诱导的十二指肠收缩有抑制作用。
4 讨论
4.1 石榴皮水提物对大鼠离体十二指肠段收缩频
率的抑制作用 本研究结果发现石榴皮水提物对大鼠的离体十二指肠段收缩频率有抑制作用，这与程会昌[4]对家兔离体十二指肠段的研究结果相类似。但是本研究发现0.5～5 mg/ml浓度的石榴皮水提物均对大鼠离体十二指肠段的收缩频率产生显著的抑制作用(P&<0.05);而程会昌[4]对家兔离体十二指肠段的研究结果显示5 mg/ml石榴皮水提物不能影响十二指肠段的收缩频率;只有当浓度达到10 mg/ml以上时，对其收缩频率的抑制作用才有显著差异。这表明不同动物十二指肠对石榴皮水提物有效成分的敏感性不同，而且大鼠较家兔的敏感性高。另外，本研究还发现石榴皮水提物对十二指肠段的收缩幅度影响不明显。
4.2 石榴皮水提物对大鼠离体十二指肠段收缩频
率抑制作用的机制 正常情况下，肌间神经丛内的多巴胺能中间联络神经元，通过释放多巴胺，在多巴胺受体的介导下，抑制兴奋性运动神经元(乙酰胆碱能)活动，进而使平滑肌兴奋性降低、收缩活动减少。吗丁啉(Domperidone，多巴胺受体的拮抗剂)是临床常用的促进胃肠运动的药物[6]，其作用途径为可逆的、竞争性的与兴奋性运动神经元(乙酰胆碱能)细胞膜上的多巴胺受体结合，解除了多巴胺的抑制效应，致使胆碱能神经元活动加强，平滑肌活动增加。本实验将石榴皮水提物与吗丁啉混合后作用于十二指肠段，产生的结果与吗丁啉单独作用的结果相类似，即均表现为给药后较给药前收缩频率减小，收缩幅度变大;而且混合液的幅度增大的更明显(见图2)。提示石榴皮水提物中对十二指肠段收缩频率起抑制作用的有效成分不是通过多巴胺受体途径发挥作用的;同时表明石榴皮水提物中可能有与吗丁啉起协同作用的物质。
新斯的明是可逆性的胆碱酯酶抑制剂[7]，通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，减少乙酰胆碱的分解，提高内脏运动神经元末梢与平滑肌细胞间隙内的乙酰胆碱含量，致使平滑肌收缩加强。本实验结果显示，新斯的明可使十二指肠段持续收缩，基线抬高;新斯的明与石榴皮水提物的混合液可使十二指肠段舒张，收缩频率、幅度均减少，基线下降。结果表明，石榴皮水提物中抑制十二指肠收缩频率的有效物质，可能通过影响乙酰胆碱作用途径而实现的。
参考文献
[1]武云亮.石榴资源的开发利用与产业化发展[J].资源开发与市场，1999，15(4):208-209.
[2]赵学光.内服石榴皮散并西药灌肠治疗慢性泄泻74例[J].河南中医药学刊，1998，13(5)：38-39.
[3]Ajaikumar KB， Asheef M， Babu BH，et al.The inhibition of gastric mucosal injury by Punicagranatum L. (pomegranate) methanolic extract.[J]. J Ethnopharmacol，2005， 96(1-2):171-176.
[4]程会昌，时爱菊，王军，等.石榴皮提取物对家兔离体肠管运动的影响[J].河南农业科学，2008，(7):114-116.
[5]艾洪滨.人体解剖生理学实验教程[M].北京:科学出版社，2004:182.
[6]许兴林，袁金仁，金玉弟，等.胆维他、康复新液联合治疗胆汁反流性胃炎疗效分析[J]. 中华现代内科学杂志，2006，3(3)：304-306.
[7]王爱忠，包艳屏，徐慧芳.鞘内注射新斯的明用于术后镇痛的临床研究[J].上海医学，2002，25(增刊)：62-63.