作者：翁开枝， 谢晓宝，邱国强， 吴浩清， 顾伟英
【关键词】 慢性髓性白血病;，树突细胞;，免疫治疗
[摘 要] 目的: 为研究临床注射用IFNα+GMCSF诱导慢性髓性白血病（CML）患者的骨髓单个核细胞（BMMNC）向树突细胞（DC）的分化及其免疫效应。方法: 将取8例CML慢性期患者的BMMNC， 接种于用含100 mL/L人AB血清的RMPI1640培养液中， 加入不同细胞因子的组合（A组: GMSCF＋IL4; B组: 临床注射用IFNα＋GMCSF）后进行培养。培养8 d后， 在倒置显微镜下观察DC的形态， 用流式细胞术检测细胞上的表面标记。采用异基因混合淋巴细胞反应（alloMLR）检测DC刺激健康供者外周血淋巴细胞增殖的功能， 用MTT比色法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤白血病细胞的活性。结果: 在不同细胞因子组合诱导下分别培养诱导8 d后的DC， 其特征性表面标记（CD80、 CD86、 HLADR、 CD83、 CD1a）的表达率均高于培养前的DC（P&<005）; 但培养8 d的两组DC表面标记的表达率无明显差异。alloMLR在DC与淋巴细胞之比为1∶10时， B组的刺激指数高于A组（P&<005）。DC能够刺激异体T淋巴细胞产生特异性的CTL。结论: CML患者的BMMNC在GMCSF＋IFNα诱导下培养后分化的DC可较强地刺激淋巴细胞增殖并可杀伤患者的白血病细胞， 有望用于CML的免疫治疗。
[关键词]慢性髓性白血病; 树突细胞; 免疫治疗
树突细胞(DC)具有很强的激发初始T细胞应答的能力。利用细胞因子组合将白血病细胞分化为DC或DC样细胞， 对克服白血病细胞的免疫逃避机制、 逆转机体的免疫耐受、 诱导特异抗白血病免疫等具有重要意义[1]。近年研究表明IFNα可诱导产生典型的DC， 本研究将临床注射用IFNα和GMCSF组合作用于慢性髓性白血病（chronic myeloid leukemia， CML）患者的骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cell， BMMNC）向DC分化， 并观察了DC体外刺激外周血T细胞增殖及杀伤活性。
1 材料和方法
1.1 材料 Ficoll淋巴分离液购自上海试剂二厂。RMPI1640培养基干粉为Gibco公司产品。二甲基亚砜及MTT购自Sigma公司。GMCSF和IL4均为Peprotech公司产品。临床注射用IFNα购自丽珠集团苏州新宝制药厂。临床注射用GMCSF购自华北制药金坦生物技术有限公司。FITC或PE标记的鼠抗人CD80、 CD86、 HLADR、 CD83、 CD1a单克隆抗体（mAb）及其同型对照均为BD公司产品。FACScabilur型流式细胞仪为BD公司产品。
1.2 研究对象 8例未经干扰素治疗的慢性期CML患者。为2005-02/2005-08就诊于本院血液科， 男5例， 女3例， 中位年龄41岁（26~73岁）， 均为Ph染色体和融合基因阳性。诊断和分期依据参见文献[2]。
1.3 方法
1.3.1 骨髓单个核细胞（BMMNC）的分离 无菌条件下采集CML患者的骨髓3～5 mL， 肝素抗凝后， 用预先预热的RMPI1640培养液稀释2倍。另外， 取两个15 mL的无菌离心管， 加入Ficoll淋巴分离液， 将上述已稀释的骨髓用毛细吸管轻轻加在Ficoll淋巴分离液面上， 其体积比为3∶2， 以2500 r/min离心20 min。收集界面层的单个核细胞加入到15 mL离心管中， 用RPMI1640培养液洗4～5次去除血小板后计数。
1.3.2 DC定向分化 DC的培养参照参照文献[3]， 略有变动。将所获得BMMNC用含100 mL/L人AB血清的RPMI1640培养液调整细胞的密度为3×109~5×109/L， 接种于24孔培养板中， 每孔1 mL， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育2 h。轻轻吸弃未贴壁的细胞， 收集贴壁细胞的加入到含100 mL/L人AB血清的RPMI1640培养液中， 实验分为A、 B两组， A组: 加入GMCSF（8×105 U/L）＋IL4（5×105 U/L）; B组: 加入IFNα（2×105 U/L）＋GMCSF（8×105 U/L）。置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养， 每3 d半量换液1次并补充新鲜的细胞因子。
1.3.3 DC的形态学观察 细胞培养过程中， 用倒置显微镜动态观察DC的形态并摄像， 于培养的第8天， 将培养的细胞悬液富集后， 涂片自然干燥， 进行瑞氏吉姆萨染色， 在倒置显微镜下观察并摄像。
1.3.4 DC免疫表型的检测 收集培养前及培养后8 d的各组细胞， 用PBS洗涤2次， 并调整细胞密度为2×109/L， 将100 μL细胞悬液加入流式分析管中， 再分别加入FITC或PE标记的鼠抗人CD80、 CD86、 HLADR、 CD83、 CD1a mAb及其同型mAb对照各10 μL， 于4℃暗室中孵育30 min。以PBS离心洗涤1次， 加入鞘液0.2 mL， 用流式细胞术进行检测， 采用Cellquest软件采集分析数据， 每次至少分析1×104个细胞。
1.3.5 同种异体混合淋巴细胞反应（alloMLR） 健康供者的外周血单个核细胞（PBMC）经2 h的贴壁， 取非黏附细胞作为反应细胞(淋巴细胞)， 以培养8 d经终浓度为25 mg/L丝裂霉素处理的DC作为刺激细胞。将细胞密度为2×109/L的淋巴细胞与各组DC， 分别按1∶10、 1∶20、 1∶50的比例接种于96孔板中， 200 μL/孔， 同时设细胞对照孔（100 μL上述密度的淋巴细胞+100 μL RPMI1640培养液）和空白对照（200 μL的RPMI1640培养液）， 每组设3个复孔， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育96 h。终止反应前4 h， 每孔加入5 g/L的MTT 20 μL， 继续孵育4 h后， 每孔加入二甲基亚砜150 μL， 待结晶的MTT充分溶解后， 用酶标仪检测波长570 nm时的吸光度（A）值， 并计算刺激指数（SI）。SI=（实验孔的A值－空白对照孔的A值）/（T细胞对照孔的A值－空白对照孔的A值）。
1.3.6 抗原特异性CTL的诱导培养及对其杀伤活性 健康供者的PBMC经2 h的贴壁后， 取非黏附细胞（淋巴细胞）与培养第8 天的DC， 按1∶10的比例分别与两组细胞共同孵育， 5 d后进行杀伤活性的测定。分别以CML患者的白血病细胞、 K562细胞和健康供者的外周血白细胞为靶细胞， 按效靶比细胞的比例为25∶1加入到96孔板中， 每组设3个复孔， 并设立靶细胞及效应细胞的对照孔， 于37℃共孵育48 h后， 用MTT比色法检测波长570 nm的A值， 并计算CTL对靶细胞的杀伤率（%）。杀伤率=[1－（实验孔A值－效应细胞对照孔A值）/靶细胞对照孔A值]×100%。
1.3.7 统计学分析 所有数据以x±s表示， 用配对t检验分析两组DC的表型、 DC刺激淋巴细胞增殖的能力及其CTL杀伤活性的数据， 均由SPSS12.0 for Windows系统软件完成。
2 结果
2.1 DC的形态观察 新鲜分离的CML患者BMMNC为散在分布、 表面光滑的球形细胞。经2 h的贴壁， 去除悬浮的淋巴细胞分离后， 剩下的贴壁细胞加入不同细胞因子组合的培养基中诱导培养8 d后细胞上出现明显的树突状突起， 细胞形态不规则， 胞质丰富， 并有成簇现象。将培养8 d的细胞悬液富集后， 涂片自然干燥， 进行瑞氏吉姆萨染色， 在倒置显微镜下可见明显的毛刺样突起， 部分核偏位且不规则， 部分细胞中含有双核。
2.2 DC的免疫表型 在不同细胞因子组合的诱导下， 不同时间的DC的免疫表型见表1。两组中培养后第8天的DC表面CD80、 C86、 HLADR、 CD83及CD1a的表达率均明显高于培养前见图1（P&<001）; 培养8 d后两组细胞表面上述分子的表达率无明显差异。
表1 CML患者BMMNC分化的DC表型的检测（略）
aP&<0.05 vs 培养前.
图1 两组DC培养前后流式细胞术检测分析（阴影部分为培养8 d后）（略）
2.3 alloMLR 随着DC与淋巴细胞比例的升高， 两组DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力逐渐增强， 各组不同比例之间差异有统计学意义（P&<005， 图2）， 其中在DC∶淋巴细胞为1∶10时， B组的SI高于A组（P&<005）。
图2 两组DC刺激淋巴细胞增殖的alloMLR检测 （略）
aP&<005 vs A组.
2.4 各组CTL对靶细胞的特异杀伤活性的比较 MTT比色法检测结果表明， 在效靶比相同时， 两组的CTL对CML患者自身白血病细胞的杀伤率最高， 而对K562细胞和健康供者细胞的其非特异性杀伤活性低（图3）。
图3 CTL对不同靶细胞的杀伤活性（略）
aP&<0.05 vs K562 细胞; cP&<0.05 vs 健康供者的外周血细胞.
3 讨论
实验中采用临床注射用IFNα＋GMCSF诱导CML患者BMMNC向DC分化的实验表明通过8 d的诱导培养， 在两种细胞因子组合的培养体系中， CML患者BMMNC均能分化为形态特征典型的DC， 将其培养8 d后， 能表达成熟DC的特异性标记（CD83和CD1a）， 高表达HLADR， 同时CD80、 CD86等的表达也明显上调， 且两组DC上表面标记的表达率均明显高于培养前， 但两组之间的表达率无统计学意义。AlloMLR的结果显示， 两种细胞因子的组合均能刺激同种异体淋巴细胞增殖， 且随着DC∶淋巴细胞比值的增加， DC的刺激能力也随之增加。在DC∶淋巴细胞的比例为1∶10时， DC的刺激活性最强。培养的DC， 其alloMLR明显强于经典方案组（GMSCF＋IL4）。此结果表明， 临床注射用IFNα＋GMCSF能诱导BMMNC产生成熟的DC， 同时也部分地解释Cortes等[4]报道的GMCSF联合IFNα治疗CML比单用IFNα更有效的机制。本实验还表明， 由CML患者BMMNC来源DC可诱导特异性CTL杀伤白血病细胞， 而对正常细胞基本没有杀伤作用， 即对机体的副作用较少。关于临床注射液诱导CML患者BMMNC分化为DC的研究尚未有文献报道。以上数据显示， CML患者的BMMNC在GMCSF＋IFNα诱导下培养后分化的DC可较强地刺激淋巴细胞增殖并可杀伤患者的白血病细胞， 有望用于CML的免疫治疗。
参考文献
[1] Trombetta ES， Mellman I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo[J]. Annu Rev Immunol， 2005， 23: 975-1028.
[2] 宋善俊， 陆道培， 郝玉书.白血病[M]. 武汉: 湖北科学技术出版社， 2004: 433-462.
[3] 盛立霞， 邱国强， 谢晓宝， 等. 比较两种树突状细胞疫苗体外诱导白血病抗原特异T细胞应答的能力[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2005， 21(2): 205-209.
[4] Cortes J， Kantarjian H， O’Brien S， et al. GMCSF can improve the cytogenetic response obtained with interferonalpha therapy in patients with chronic myelogenous leukemia[J]. Leukemia， 1998，12(6): 860-864.