作者：刘倩， 唐亮， 李英辉， 周彩存， 谈立松， 赵玉军， 张培德， 张尚权
【摘要】 目的: 利用原核表达系统， 构建异源血管内皮生长因子融合蛋白疫苗， 研究该融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌肿瘤模型的抗血管生成主动免疫治疗效果。方法: 将鸡VEGF基因克隆入pGEX-4T-2原核表达载体， 经IPTG诱导融合蛋白表达， Ni-NTA纯化， 透析复性， 构建GST-cVEGF融合蛋白疫苗。将C57BL16J小鼠随机分为3组， GST-cVEGF疫苗组10只、 cVEGF疫苗组10只、 生理盐水组(NS) 10只。将各组样品与等体积弗氏佐剂混合， 各组小鼠每只分别0、 2、 3周免疫100 μg GST-cVEGF融合蛋白疫苗、 单纯cVEGF蛋白疫苗、 生理盐水。接种Lewis肺癌细胞， 观察肿瘤的生长情况和小鼠状态。接种肿瘤18 d后， 处死小鼠， 剥离肿瘤称重。检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度。结果: GST-cVEGF疫苗组、 cVEGF组、 生理盐水组肿瘤均重分别为(1.55±0.534) g、 (1.93±0.607) g、 (2.87±0.642) g。GST-cVEGF疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P&<0.01)。疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴度为1∶2000。结论: 异种血管内皮生长因子基因重组融合蛋白疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受， 可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体， 并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。
【关键词】 血管内皮生长因子 融合蛋白疫苗 肿瘤/免疫治疗 小鼠
肿瘤的生长、 转移及其预后依赖于血管生成。血管内皮生长因子(vascular endothdial growth factor， VEGF)是迄今发现最重要的血管生成因子之一［1］。近年来以VEGF及其受体(vascular endothelialgrowth factor receptor， VEGFR)作为靶分子的抗肿瘤新药研发取得了很大的进展， 已经有数个药物经美国FDA批准上市。重组人源化的鼠单克隆抗体（mAb）Avastin［2］， 可有效地抑制多种人类肿瘤细胞移植瘤的生长， 高亲合力地结合VEGF， 可直接阻断VEGF通过VEGFR的信号表达。本研究中， 我们构建了谷光甘肽硫转移酶（GST）与鸡源VEGF(cVEGF)融合基因的原核表达重组质粒， 在大肠杆菌中进行蛋白质诱导表达， 并对表达产物进行分离纯化及复性， 再进一步研究该融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌肿瘤模型的抗血管生成主动免疫治疗效果。
1 材料和方法
1.1 材料 质粒抽提试剂盒、 胶回收试剂盒、 各种限制性核酸内切酶、 ExTaq酶、 T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司; 弗氏完全佐剂， 不完全佐剂购自Sigma公司; 重组人VEGF165抗原购自美国Pepro Tech EC公司; 山羊抗小鼠IgG-HRP购自Santa Cruz公司; 96孔酶标板NUNC公司产品; 次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA)和蛋白质分离纯化柱购自Qiagen公司; 小鼠Lewis肺癌细胞株由本实验室保存; 4周龄C57BL/6J小鼠（♀）购自中国科学院上海生化细胞研究所。
1.2 方法
1.2.1 VEGF基因克隆及原核表达载体的构建 为了利于表位之间以及表位与蛋白之间的融合， 在GST的基因序列与cVEGF基因序列之间引入6个Gly的柔性接头序列， 并在下游引入HIS-Tag基因序列以便于对表达产物进行分离纯化， 设计带EcoR I-Xho I酶切位点的引物Primer I (由上海赛百盛基因技术有限公司合成): 上游: 5′-GCGAATTCCGGGCGGTGGCGGTGGCGGTAACTTTCTGCTCACTTGGATC-3′。下游: 5′-GC-CTCGAGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCCGTCTCGGTTTTTCACA-3′。以pMD18-T-cVEGF质粒（本实验室保存）为模板， PCR扩增， 条件为: 94℃变性4 min; 94℃ 30 s， 58℃ 30 s， 72℃ 1 min， 共30个循环; 最后72℃延伸10 min。PCR产物经酶切回收连接至pGEX-4T-2原核表达载体， 并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。PCR和双酶切鉴定， 并进行测序鉴定(捷瑞生物工程(上海)有限公司测部)。
1.2.2 融合蛋白的诱导表达及分离纯化 挑取阳性菌株， 在终浓度为0.8 mmol/L的IPTG诱导表达。分别收取诱导前后标本， 超声破菌， 作聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。大规模诱导培养菌体， 将所得包涵体经洗涤液（含5 g/L Triton X-100， 10 mmol/L EDTA， pH8.0)反复洗涤3次， 再分别用2 mol/L， 4 mol/L尿素洗涤3次， 变性溶解在含10 mmol/L巯基乙醇的8 mol/L尿素中， 按Qiagen公司方法， 采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白质， 经核酸蛋白检测仪检测收集洗脱峰， 并取样做SDS-PAGE分析。
1.2.3 包涵体的复性 将过柱纯化后的蛋白稀释为100 g/L， 分别在4 mol/L、 2 mol/L尿素溶液中透析12～24 h。再将其放在含150 mL/L甘油、 0.5 mol/L精氨酸、 1 g/L PEG2000、 1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)和1 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、 20 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)的复性溶液中透析复性12～24 h。最后用含9 g/L NaCl、 20 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液透析48 h。每6 h换液1次。
1.2.4 融合蛋白疫苗免疫实验动物 将4周龄C57BL/6J 小鼠（♀）随机分组， 每组10只， 分别命名为GST-cVEGF免疫组、 cVEGF免疫组、 NS对照组。将各免疫组样品与等体积弗氏佐剂充分混合成油包水状态， 前2次为弗氏完全佐剂， 第3次为弗氏不完全佐剂。以每只100 μg蛋白的量经脚掌、 颈背部皮下多点注射。免疫程序为0、 2、 3周， 三针法免疫。
1.2.5 肺癌动物模型的建立及抗肿瘤效果评价选 选取Lewis肺癌细胞株， 以106个细胞/只的量腿部内侧皮下接种4周龄未经免疫的C57BL/6J小鼠， 两周后无菌环境下取出瘤体， 研磨器研磨， 制备细胞悬液并计数， 再以5×105个细胞/100 μL/只的量右上肢腋窝皮下接种经免疫3次的C57BL/6J小鼠。在肿瘤可见后， 用游标卡尺每隔1 d观察小鼠生存情况并测量肿瘤长、 宽、 高径， 计算肿瘤体积(mm3)=0.52×长×宽×高径， 绘制肿瘤生长曲线。肿瘤接种后18 d所有发瘤动物， 眼球取血， 脱颈椎处死， 完整剥离肿瘤， 用精度1 mg的天平称重量， 计算抑瘤率: 抑瘤率=(对照组瘤体积－实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100%。
1.2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清抗VEGF抗体滴度 用包被液(碳酸盐缓冲液， pH9.6)溶解的rhVEGF(2 mg/L)包被96孔酶标板(100 μL/孔)， 4℃过夜。PBST(0.5 g/LTween20溶于PBS) 洗涤3次后， 每孔加入等比稀释浓度的被检小鼠血清100 μL， 试剂空白组加入生理盐水100 μL， 37℃孵育2 h。PBST洗涤后， 加入山羊抗小鼠IgG-HRP 100 μL 37℃孵育2 h， 经PBST充分洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。15 min后硫酸终止， 在酶标仪上测定A450值， 扣除试剂空白组吸光值后得最后结果。
1.2.7 统计学处理 实验中的数据采用单因素方差分析， t检验， 数据采用x±s表示。P&<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒鉴定及序列分析 pGEX-4T-2空载体相对分子质量（Mr）约4900 bp， 筛选的阳性克隆pGEX4T2-cVEGF Mr约5470 bp， 经EcoR I、 Xho I双酶切后产生4900 bp和570 bp2条DNA片段， 用Primer I作PCR鉴定产生约570 bp的片段（图1）， 均与预期结果一致。测序鉴定结果显示与基因库提供的序列完全一致。
2.2 融合蛋白的表达纯化与复性 GST-cVEGF经IPTG诱导， 将诱导前后的样品处理后作SDS-PAGE分析， 结果显示在Mr为48000左右出现了一条新的蛋白质表达条带(图2)， 并且目的蛋白以包涵体形式存在， 与预期Mr相符， 经分析表达产物占细菌总蛋白的30%左右， 说明融合蛋白GST-cVEGF在大肠杆菌中得到了高效表达。大肠杆菌BL21在同样条件下诱导后在48000 bp处没有阳性表达条带。大量诱导表达， 收集包涵体， 经包涵体纯化后， 变性溶解于含10 mmol巯基乙醇的8 mol/L尿素， 流经Ni-NTA柱， 用不同咪唑梯度的洗脱液洗脱， 获得纯度达85%以上(光密度扫描)的重组融合蛋白质(图2)。稀释纯化后的蛋白使其以起始浓度为100mg/L， 分别在4mol/L、 2mol/L尿素溶液中透析12～24h。随后在蛋白复性溶液中透析复性12～24 h， 使其以可溶的形式存在。用Braford法测定蛋白的含量， 据此计算出GST-cVEGF复性后的回收率为53%。
图1 重组质粒pGEX4T2-cVEGF酶切和PCR鉴定（略）
1: DNA marker; 2: pGEX4T2-cVEGF重组质粒的PCR鉴定; 3: pGEX4T2-cVEGF重组质粒EcoR I/Xho I双酶切鉴定; 4: pGEX4T2-cVEGF重组质粒EcoR I单酶切鉴定; 5: DNA marker.
图2pGEX4T2-cVEGF表达产物及纯化后产物的SDS-PAGE分析（略）
1: 纯化后的GST-cVEGF融合蛋白; 2: 蛋白标准分子量; 3: 未经IPTG诱导的含pGEX4T2-cVEGF重组质粒的BL21(DE3)菌株; 4: 经IPTG诱导的含pGEX4T2-cVEGF重组质粒的BL21(DE3)菌株; 5: 经IPTG诱导的BL21(DE3)菌株.
2.3 动物试验结果
2.3.1 肿瘤体积的测量和生存率的测定 小鼠肿瘤生长曲线显示（图3）， 接种肿瘤至肿瘤出现的时间间隔不相同， 在接种肿瘤后第7天可见NS对照组肿瘤生长， 而GST-cVEGF疫苗组的潜伏期最长， 肿瘤生长速度最慢。cVEGF组的肿瘤生长速度较NS对照组缓慢， 隔天测量的肿瘤体积也小于NS对照组(P&<0.01)。
图3 接种肿瘤细胞后小鼠肿瘤生长曲线（略）
2.3.2 肿瘤重量和抑瘤率 肿瘤接种后18 d处死小鼠解剖肿瘤称重后发现， GST-cVEGF的平均肿瘤为(1.55±0.534) g， 较NS对照组2.87 g比较差异有统计学意义(P&<0.01)， 计算抑瘤率达46%， cVEGF较对照也有统计学意义(P&<0.05); 各作用组之间比较发现GST-cVEGF融合蛋白疫苗组较单独cVEGF蛋白疫苗组高（P&<0.05， 表1）。
表1 各组小鼠肿瘤重量和抑瘤率（略）
-aP&<0.05， bP&<0.01 vs NS.
2.3.3 ELISA法检测血清抗VEGF抗体滴度 间接法ELISA检测小鼠血清抗VEGF抗体的滴度， GST-cVEGF蛋白疫苗组稀释比例1∶100至1∶2000血清A450值可以认为有效的阳性结果， 与NS对照组比较差别有高度统计学意义（P&<0.01）， 与cVEGF疫苗组比较差别有统计学意义（P&<0.05）， 结果见表2。
表2 各实验组小鼠血清抗VEGF抗体滴度测定的ELISA结果（略）
aP&<0.05， bP&<0.01 vs NS.
2.3.4 安全性观察 实验过程中， 各实验组小鼠体质量增加无统计学意义(P&>0.05)。免疫过程中小鼠皮毛出现干燥杂乱， 粪便色泽及形态正常， 食欲， 行为等均未出现与处理有关的改变。小鼠处死后， 肉眼观肝、 脾无明显增大， 组织切片显微镜下观察肝、 肺和肾脏均无实质性病变。因此， 蛋白疫苗具有良好的安全性。
3 讨论
VEGF是一种功能强大且能产生多种生物学效应的细胞因子， 大量研究结果表明VEGF在许多癌症组织中过量表达。VEGF通过与VEGFR的胞外段结合使后者构象发生变化， 导致受体二聚化， 其胞内段酪氨酸位点发生自磷酸化， 激活下游的信号转导通路。目前以VEGF/VEGFR为靶向的抗肿瘤药物在临床实验中取得了较好的抗肿瘤效应， 如抗VEGF或VEGFR的mAb［3， 4］， 酪氨酸激酶受体抑制剂［5， 6］， 可溶性的VEGFR（VEGF Trap）等［7］。mAb Avastin与化疗药物联合虽然在临床治疗肿瘤中取得了成功。但mAb制备难度大、 成本高、 制剂昂贵而不能广泛、 长期应用。蛋白疫苗作为一种大分子物质， 其表面存在大量的抗原表位， 经抗原提呈细胞加工提呈后诱导机体产生特异性细胞及体液免疫应答。基因重组方法获得的蛋白疫苗可大量生产， 并易于商品化。
VEGF属于内源性抗原， 在进化上高度保守， 在种间存在着很高的同源性， 为此， 魏于全院士提出以异种同源基因诱导机体产生自身免疫进行肿瘤免疫治疗的理论并取得了很好的效果［8］。在此基础上我们采用鸡源VEGF做为异种同源免疫原构建蛋白疫苗。鸡源VEGF作抗原， 对小鼠和人都是外源性抗原， 小鼠动物试验结果对临床具有较高参考价值。免疫学中， 为增加其弱抗原的免疫原性， 常用的办法是将这些成份连接到有强抗原特性的蛋白载体。本研究中， 我们采用pGEX-4T-2作为原核表达载体， 该载体上自带有的GST基因序列， 经诱导表达后产生GST， 这样既是表达载体又是免疫载体， 以增加VEGF的免疫原性， 用于肿瘤主动免疫治疗。上述实验结果表明: 与鼠源VEGF氨基酸相比同源性为68.06%的鸡源VEGF融合蛋白产生的内源性抗体的抗肿瘤效果较单纯鸡源VEGF蛋白明显， 这说明了GST起到了增强了cVEGF的免疫原性的作用， 是强有力的分子佐剂。
在实验中我们采取了先免疫后植瘤的实验策略， 并不是意味着用于肿瘤预防。首先是， 由于Lewis肺癌生长迅速， 在无外界治疗因素干预的情况下， 3周左右的时间内可使小鼠致死， 这短期内抗体若达不到有效浓度， 不会产生疗效。其次， 在融合蛋白疫苗单因素干预的动物实验研究水平上， 先免疫后植瘤可以更好的摸索和优化有关插人片段的选择、 免疫剂量、 免疫途径等的实验条件， 也更好的比较各实验组之间抑制肿瘤生长的差异性。在以后的研究中， 研究合适的剂量、 合适免疫途径、 适当加长免疫时间， 与DNA疫苗联合应用等可能改善抗肿瘤效果。我们还可考虑将疫苗与其他抗肿瘤方法如化疗、 放疗联合进行。今后我们将对此做进一步研究。
参考文献
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