【摘要】 自然界在骆驼体内存在缺失轻链的重链抗体， 克隆其可变区得到的单域抗体是最小的功能性抗原结合片段， 相对分子质量（Mr）仅为15000， 称为纳米抗体， 具有Mr小、 稳定性强、 可溶性好、 易表达， 免疫原性低等特点。这种小型化的基因工程抗体在基础研究、 开发新药和疾病的诊断和治疗上具有广阔的应用前景。
【关键词】 纳米抗体 重链抗体 VHH
抗体技术已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中， 新型基因工程抗体不断出现， 包括嵌合抗体、 人源性抗体等。抗体小型化是抗体基因工程研究的主要研究方向之一， 如一些单价小分子抗体scFv， 但在稳定性、 表达产量、 蛋白酶抵抗性和聚合性方面仍有待改进。
1989年， Ward等研制出由重链可变区（VH）组成的抗原结合片段， 命名为单域抗体或dAbs。然而， 其抗原亲合力低，易聚合。1993年， Hamers-Casterman等［1］报道骆驼的功能性抗体都由重链组成， 天然缺失轻链， 即重链抗体（HCAbs）。克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody， VHH)， 晶体结构直径2.5 nm、 长4 nm， 因此称为纳米抗体。在这里我们对其独特的生物物理性质及其应用做一阐述。
1 纳米抗体的结构特征
纳米抗体具有完整的抗原结合片段。骆驼的HCAbs具有独特的重链可变区（VHH），一个铰链区和两个恒定区（Ch3和CH3）。恒定区CH1是与轻链锚定的部位， 在纳米抗体的基因组中存在， 但在mRNA形成中被剪切掉， 所以纳米抗体缺乏轻链［2］。因此， 纳米抗体靠仅有的3个CDRs就具备了特异的抗原结合能力和高亲合力， 而普通抗体则需要6个CDRs。
纳米抗体的晶体和水溶性结构由2个β片层组成支架， 类似普通抗体的VH免疫球蛋白折叠。纳米抗体的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大， CDR3区也更长。人和小鼠VH的CDR3平均长度分别为12和9个氨基酸， 而纳米抗体则为16～18个氨基酸。纳米抗体包含了骨架区（framework region， FR）的氨基酸残基， 因此纳米抗体能补偿抗原结合位点VL的缺乏。普通抗体的FR2中， V37， G44， L45和W47这4个氨基酸残基参与VL的相互作用， 而在纳米抗体中， 这几个氨基酸残基发生了改变， 突变为F37， E44， R45， G47， 由疏水性变为亲水性， 使纳米抗体更易于溶解［3］。利用这一特点， 对人源抗体VH结构域FR2中的一些氨基酸进行VHH特征性改造， 即在人VH区的44、 45和47位点氨基酸残基用纳米抗体中相对应的代替， 所得到的骆驼化单域VH抗体不仅保持原有抗体的特异性和亲和力， 且溶解性好、 稳定性好［4］。基因工程化纳米抗体结构的稳定性和可溶性还与CDR长度和多样性相关的突变有关。
比较人类VH3基因序列与骆驼的VHH胚系基因序列， 发现二者有高度的同源性。另外， 在小鼠B或T细胞缺乏对纳米抗体的免疫应答。因此， 带有人VHFR2烙印的纳米抗体的建立可能是获得非免疫原性纳米抗体的方法。
2 纳米抗体的特性
纳米抗体的单域性质使其较普通抗体具有一些独特的性质。
2.1 容易制造和表达 纳米抗体是Mr为15000的单域蛋白。重组纳米抗体通常在E.coli中表达量为10 mg/L。从真菌和酵母中能高水平分泌纳米抗体， 在振荡培养的酵母菌（saccbaromyces cerevisiae）中产量为100 mg/L， 而10 L的补料发酵方法能获得大于1 g/L的产量。从15 m3的发酵中可以获得大于1 kg的纳米抗体［5］。
2.2 纳米抗体的高水溶性和稳定性 VH结构域单独表达时通常形成包涵体， 或者暴露的疏水域相互黏附。由于在纳米抗体中FR2中的疏水残基被亲水残基代替， 纳米抗体水溶性增加， 聚合性减少， 即使以包涵体形式表达， 纳米抗体也很容易复性。
一些纳米抗体能耐高温且具有高度的构像稳定性。在37℃孵育1周后纳米抗体仍具有80%的结合活性。另外， 它具有可逆的去折叠能力， 将它长期放在高于90℃的环境后仍能重新获得抗原结合能力［6］。纳米抗体的熔点在60～78℃［7］， 而其他的抗体及其片段常会在热变性后不可逆的聚合。纳米抗体还显示出在离液剂［7］、 存在蛋白酶和极度pH值下的变性效应下具有高度稳定性。因此， 在苛刻的条件中纳米抗体能保持稳定性， 如胃液和内脏中， 为口服治疗胃肠道疾病提供新的思路。
2.3 纳米抗体识别独特的构造表位 纳米抗体比普通抗体有更广泛的抗原结合能力， 从小分子的半抗原和肽， 到大分子的蛋白和病毒。甚至当靶蛋白紧密包裹隐藏了普通抗体识别的位点时， 小分子的纳米抗体也可以对其进行表位识别［8］。纳米抗体的CDR3区可以形成一个大的暴露的凸环， 凸环中的二硫键使其结构稳定， 这个长CDR3环能结合蛋白空间构像上的裂隙和空腔 ，参与大部分抗原结合反应。所以， 从纳米抗体中可以容易地找到酶的抑制剂、 受体的激动剂或拮抗剂等。普通抗体的抗原结合表面常形成一个凹面或平面， 与抗原作用后会被固定， 在结合能上产生阴性反应（熵效应）。骆驼纳米抗体的长CDRs环大部分折叠在FR2上， 在这里疏水残基受保护，避免与外界水性环境接触。另外， CDR3环包含一个半胱氨酸， 与CDR1（或45位点）形成二硫键。这种二硫键的存在能够稳定CDR3形成的凸环结构， 从而降低与抗原的结合能［9］。
3 纳米抗体的应用价值
纳米抗体具有独特的性质如Mr小、 水溶性好、 稳定性强、 抗原识别能力强、 易于生产等。因此在生物技术和医学应用方面， 比其他抗体具有优越性。
3.1 纳米抗体用于构建多种分子结构 双特异性和双功能抗体在免疫诊断和治疗上有许多实用性。双特异性抗体能结合一个靶抗原的相邻的两个位点， 从而获得对抗原的高亲合力。双功能抗体能传递毒性载体， 如放射性核素、 细胞毒性药物等到靶抗原， 包括癌细胞。这种多特异性分子的理想性质是: 小分子、 高水溶性、 高稳定性、 缺乏聚合或蛋白水解倾向、 高表达产量。以scFv构建的双特异性和双功能抗体， 表达水平低、 易聚合和被蛋白水解， 阻碍了大规模的临床发展。
纳米抗体的严格单域本质， 高水溶性和高稳定性， 构造的双功能或二价体蛋白在细菌中能高表达， 完全保留原有的功能。Zhang等［10］将从天然纳米抗体库中筛选的单域纳米抗体五聚化， 极大地提高了与抗原的亲和力。五聚体纳米抗体表现出良好的热力学稳定性以及不易被蛋白酶所降解等特性。
将酶或毒素蛋白的基因与纳米抗体的基因融合可产生一些免疫毒性和其他免疫交联物。使其在组织穿透力、 清除速度以及稳定性上比其他抗体更具优势。S-layer(晶体细菌表面蛋白)蛋白和纳米抗体的基因融合产生的融合蛋白能自发的结晶为单体性蛋白晶格， 作为纳米模式的感觉层用于检测低浓度抗原［11］。
一种基因工程改造的载脂蛋白I能治疗罗德西亚布氏锥虫病， Toya等［12］将能识别锥虫病各种表面糖蛋白的隐藏位点的纳米抗体与之结合， 在小鼠能有效的治愈该病，并缓解急慢性感染。
3.2 纳米抗体作为稳定内在易变或不稳定蛋白的模式 D67H变异体是一个自然形成的突变体， 产生在系统性神经性淀粉样变， 对人淀粉样变的特异性纳米抗体在体外能使之形成部分非折叠的形式， 显著抑制其聚合。为治疗蛋白沉淀疾病设计合理的药物提供了一个新的方法［13］。纳米抗体与一种内在易变蛋白， 成瘾解毒剂MazE结合后， 能稳定抗原， 保持其晶体结构［14］。
3.3 纳米抗体作为细胞内抗体 抗体的细胞内表达是体外抑制目标分子功能的重要工具。事实上， 大部分抗体没有细胞内功能， 因为在细胞质还原环境中不能形成二硫化合物， 或者靶向亚细胞部位比较困难。而且， 很少有抗体能结合到酶的活性位点， 因此， 它们一般不能中和酶的活性。Jobling等［15］证明了纳米抗体能正确的靶向亚细胞组分， 在植物中比反义实验更能有效的抑制酶的功能。因为纳米抗体通常比scFv更稳定， 甚至在细胞质还原环境中能更好的维持其抗原结合能力。细胞内表达的纳米抗体与猪的内源性逆转录病毒Gap多肽的p15基质蛋白结合能阻止猪内源性病毒的产生［16］。Aires da Silva等［17］将针对HIV-1的Vif蛋白的scFv的VH区进行了VHH特征性改造， 发现改造后的抗体在细胞内能有效表达， 并具有很好的溶解性， 能够与Vif蛋白结合， 中和HIV-1病毒的感染。另外， 内抗体也可能用于阻断细胞内的信号通路。
4 纳米抗体在肿瘤的诊断和治疗中的应用
4.1 纳米抗体作为肿瘤的诊断工具 疾病早期快速而便捷的体外诊断和监测治疗效果， 是癌症诊断中的一个主要难题。理想的癌症成像介质具有渗透性好， 非特异性噪声背景低， 未结合的能迅速从系统清除以减少靶向-本底比值。单克隆抗体(mAb)显影剂组织穿透性差， 不易清除。纳米抗体与靶结合位点的高亲合力， 能快速清除多余非结合纳米抗体， 具有优良的穿透能力。识别溶菌酶的纳米抗体， 在体外能抑制溶菌酶的活性， 同时能有效靶向大块的肿瘤和转移性兵变， 而多余未结合的纳米抗体能迅速的从周围正常组织中清除。放射性标记的纳米抗体给药后数小时， 肿瘤-血流比值上升到10［17］。还可将半衰期短的放射性核素， 如99mTc和123I， 标记纳米抗体后进行肿瘤成像。
前列腺癌的早期检测和分期是基于在血流中的前列腺特异性抗原（PSA）的检测。然而， 血液中存在PSA的不同亚型。Saerens等［18］发现纳米抗体能区别不同亚型的PSA， 可用于区别不同阶段的前列腺癌。纳米抗体还是免疫细胞化学中很好的工具， 也可在免疫组化和免疫印迹检测眼咽肌肉疾病。
4.2 纳米抗体在肿瘤治疗中的用途 由于纳米抗体的高亲合力和特异性， 小分子的纳米抗体尤其适合在梗阻部位靶向结合抗原， 能渗入血管少的组织。而且，纳米抗体的免疫原性很低， 在动物实验中， 纳米抗体的重复给药未检测到任何体液和细胞免疫反应［19］。
由于纳米抗体可以用于构建多种分子结构， 可以传输一些分子为治疗提供辅助功能。如传递毒性有效载荷到肿瘤组织， 而减少毒性化合物对健康细胞的损伤。将纳米抗体直接结合在癌胚抗原和一个细菌β内酰胺酶之间， 构建双功能融合蛋白， 能完全治愈LS174T人腺癌异种移植物，而没有任何副作用［19］。
经遗传修饰的细菌作为自杀基因载体可以选择性地破坏肿瘤细胞。为提高这些细菌定向肿瘤的能力， 可以将靶向分子如抗体表达在其表面。由于纳米抗体的高度稳定性和低聚合倾向， 纳米抗体为基础的多种结构能有效的转位到细菌细胞表面。
穿过血脑屏障的治疗仍然是神经性疾病和脑肿瘤治疗中的一个主要课题。纳米抗体能穿过人血脑屏障内皮细胞， 通过表达在脑毛细血管受体传递大分子穿过血脑屏障向细胞内转移［20］。
纳米抗体作为细胞内抗体， 能够中和或调节位于特定亚细胞部位的原癌基因分子的活性， 或者触发抗肿瘤免疫。通过建立肿瘤细胞免疫的纳米抗体库， 筛选肿瘤细胞特异性的纳米抗体， 利用纳米抗体识别肿瘤细胞表面抗原， 从而得到肿瘤治疗靶标。
在治疗时不仅希望药物能快速清除， 也希望能延长血清半衰期以增加抗体与靶点的作用时间， 减少用药剂量。一些方法能增加抗体的半衰期， 如聚乙二醇化（PEGylation）， 与白蛋白结合或融合， 与抗体的Fc融合。新生受体FcRn能调节IgG和白蛋白的半衰期。这些方法也将能用于增加纳米抗体的血清半衰期。
5 结语
纳米抗体从发现至今， 已经发展为有广泛生物应用价值和临床应用价值的高度通用分子。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段， 具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力， 能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用， 使之作用类似于抑制剂。因此， 纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链， 纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质， 如处于极端温度和pH环境中的稳定性， 可以低成本制造大产量。因此， 纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值， 在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
参考文献
［1］ Hamers-Casterman C， Atarhouch T， Muyldermans S， et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains［J］. Nature， 1993， 363(6428): 446-448.
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［3］ Muyldermans S， Atarhouch T， Saldanha J， et al. Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains［J］. Protein Eng， 1994， 7(9): 1129-1135.
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［9］ Transue TR， De Genst E， Ghahroudi MA， et al. Camel single-domain antibody inhibits enzyme by mimicking carbohydrate substrate［J］. Proteins， 1998， 32(4): 515-522.
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［15］ Jobling AS， Jarman C， Teh MM， et al. Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antibodies ［J］. Nat Biotechnol， 2003， 21(1): 77-80.
［16］ Dekker S， Toussaint W， Panayotou G， et al. Intracellularly expressed single domain antibody against p15 matrix protein prevents the production of porcine retroviruses［J］. J Virol， 2003， 77(22): 12132-12139.
［17］ Aires Da Silva F， Santa-Marta M， Freitas-Vieira A， et al. Camelized rabbit-derived VH single-domain intrabodies against Vif strongly neutralize HIV-1infectivity［J］. J Mol Biol， 2004， 340(3): 525-542.
［18］ Saerens D， Kinne J， Bosmans E， et al. Single-domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen［J］. J Biol Chem， 2004， 279(50): 51965-51972.
［19］ Cortez-Retamozo V， Backmann N， Senter PD， et al. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate［J］. Cancer Res， 2004， 64(8): 2853-2857.
［20］ Muruganandam A， Tanha J， Narang S， et al. Selection of phage- displayed llama single-domain domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium［J］. FASEB J， 2001， 16(2): 240-242.
3.3 纳米抗体作为细胞内抗体 抗体的细胞内表达是体外抑制目标分子功能的重要工具。事实上， 大部分抗体没有细胞内功能， 因为在细胞质还原环境中不能形成二硫化合物， 或者靶向亚细胞部位比较困难。而且， 很少有抗体能结合到酶的活性位点， 因此， 它们一般不能中和酶的活性。Jobling等［15］证明了纳米抗体能正确的靶向亚细胞组分， 在植物中比反义实验更能有效的抑制酶的功能。因为纳米抗体通常比scFv更稳定， 甚至在细胞质还原环境中能更好的维持其抗原结合能力。细胞内表达的纳米抗体与猪的内源性逆转录病毒Gap多肽的p15基质蛋白结合能阻止猪内源性病毒的产生［16］。Aires da Silva等［17］将针对HIV-1的Vif蛋白的scFv的VH区进行了VHH特征性改造， 发现改造后的抗体在细胞内能有效表达， 并具有很好的溶解性， 能够与Vif蛋白结合， 中和HIV-1病毒的感染。另外， 内抗体也可能用于阻断细胞内的信号通路。
4 纳米抗体在肿瘤的诊断和治疗中的应用
4.1 纳米抗体作为肿瘤的诊断工具 疾病早期快速而便捷的体外诊断和监测治疗效果， 是癌症诊断中的一个主要难题。理想的癌症成像介质具有渗透性好， 非特异性噪声背景低， 未结合的能迅速从系统清除以减少靶向-本底比值。单克隆抗体(mAb)显影剂组织穿透性差， 不易清除。纳米抗体与靶结合位点的高亲合力， 能快速清除多余非结合纳米抗体， 具有优良的穿透能力。识别溶菌酶的纳米抗体， 在体外能抑制溶菌酶的活性， 同时能有效靶向大块的肿瘤和转移性兵变， 而多余未结合的纳米抗体能迅速的从周围正常组织中清除。放射性标记的纳米抗体给药后数小时， 肿瘤-血流比值上升到10［17］。还可将半衰期短的放射性核素， 如99mTc和123I， 标记纳米抗体后进行肿瘤成像。
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4.2 纳米抗体在肿瘤治疗中的用途 由于纳米抗体的高亲合力和特异性， 小分子的纳米抗体尤其适合在梗阻部位靶向结合抗原， 能渗入血管少的组织。而且，纳米抗体的免疫原性很低， 在动物实验中， 纳米抗体的重复给药未检测到任何体液和细胞免疫反应［19］。
由于纳米抗体可以用于构建多种分子结构， 可以传输一些分子为治疗提供辅助功能。如传递毒性有效载荷到肿瘤组织， 而减少毒性化合物对健康细胞的损伤。将纳米抗体直接结合在癌胚抗原和一个细菌β内酰胺酶之间， 构建双功能融合蛋白， 能完全治愈LS174T人腺癌异种移植物，而没有任何副作用［19］。
经遗传修饰的细菌作为自杀基因载体可以选择性地破坏肿瘤细胞。为提高这些细菌定向肿瘤的能力， 可以将靶向分子如抗体表达在其表面。由于纳米抗体的高度稳定性和低聚合倾向， 纳米抗体为基础的多种结构能有效的转位到细菌细胞表面。
穿过血脑屏障的治疗仍然是神经性疾病和脑肿瘤治疗中的一个主要课题。纳米抗体能穿过人血脑屏障内皮细胞， 通过表达在脑毛细血管受体传递大分子穿过血脑屏障向细胞内转移［20］。
纳米抗体作为细胞内抗体， 能够中和或调节位于特定亚细胞部位的原癌基因分子的活性， 或者触发抗肿瘤免疫。通过建立肿瘤细胞免疫的纳米抗体库， 筛选肿瘤细胞特异性的纳米抗体， 利用纳米抗体识别肿瘤细胞表面抗原， 从而得到肿瘤治疗靶标。
在治疗时不仅希望药物能快速清除， 也希望能延长血清半衰期以增加抗体与靶点的作用时间， 减少用药剂量。一些方法能增加抗体的半衰期， 如聚乙二醇化（PEGylation）， 与白蛋白结合或融合， 与抗体的Fc融合。新生受体FcRn能调节IgG和白蛋白的半衰期。这些方法也将能用于增加纳米抗体的血清半衰期。
5 结语
纳米抗体从发现至今， 已经发展为有广泛生物应用价值和临床应用价值的高度通用分子。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段， 具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力， 能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用， 使之作用类似于抑制剂。因此， 纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链， 纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质， 如处于极端温度和pH环境中的稳定性， 可以低成本制造大产量。因此， 纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值， 在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
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［11］ Pleschberger M， Saerens D， Weigert S， et al. An S-layer heavy chain camel antibody fusion protein for generating of a nanopatterned sensing layer to detect the prostate specific antigen by surface plasmon resonance technique［J］. Bioconjug Chem， 2004， 15(3): 664-671.
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