作者：王新华， 胡敬东， 孔娜， 李宏梅， 赵宏坤
【摘要】 目的: 研究表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和β-环糊精（β-CD）组成的人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性， 以提高鸡IL-18重组蛋白复性率， 获得更多具有良好活性的蛋白。方法: 将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）， 并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、 洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解， 使蛋白彻底变性， 然后利用人工分子伴侣系统辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后， 利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。结果: 经SDS-PAGE分析表明， 表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性， 鸡IL-18重组蛋白获得了42.54%复性率。鸡淋巴细胞增殖试验表明，表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。结论: 人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性， 获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性， 为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。
【关键词】 人工分子伴侣系统 鸡白细胞介素18重组蛋白 β-环糊精 复性 表面活性剂
［Abstract］ AIM: To study the technique of boosting the renaturation yield of rChIL-18 by using aritificial molecular chaperone composed of cetyl trimethyl ammonium bromide(CTAB) and β-cyclodextrin(β-CD). METHODS: The recombinant plasmid of mChIL-18 prokaryotic expression was transformed into E.coli BL21(DE3) strain and then induced by IPTG at 37℃. The recombinant mChIL-18 was expressed efficiently in inclusion bodies in E.coli. After crushed and washed， the inclusion bodies were thoroughly denatured with 6 mol/L of guanidine hydrochloride， and then the artificial molecular chaperone was used to promote protein refolding. After the rehabilitation of products was purified by bag filter， its activity was detected by lymphocyte proliferation assays. RESULTS: The SDS-PAGE analysis indicated the expressed ChIL-18 protein had molecular weight of 44 000. The expressed product existed in the form of inclusion body.Two protein bands of Mr 44 000 and 26 000 appeared on SDS-PAGE gel. The percentage of renaturation was 42.54 with artificial molecular chaperone.The results of MTT assay showed the expression of ChIL-18 protein in E.coli BL21(DE3) greatly induced the proliferation of chicken T lymphocytes. CONCLUSION: The artificial chaperone technique can obviously boost the renaturation yield of rChIL-18. The purified and expressed product of fusion chicken Interleukin-18 gene in E.coli have relativity high bioactivity.
［Keywords］artificial molecular chaperone; chicken IL-18 recombination protein; β-cyclodextrin; refolding; surfactant
白细胞介素18（interleukin-18， IL-18）也称为γ干扰素（IFN-γ）诱导因子（interferonγ-inducing factor， IGIF）， 是Okamura等［1］首次从小鼠肝脏中克隆获得的， 它具有增加FasL的表达以及增强NK细胞毒性作用等多种生物学效能， 在免疫调节、 抗感染及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用［2］。本实验室对于鸡IL-18成熟蛋白基因已经构建了其原核表达质粒pGEX-mChIL-18［3］。该质粒在大肠杆菌中是以包涵体的形式高效表达， 然而包涵体是无活性固体颗粒， 所以必须经过蛋白质复性使其变成有活性的蛋白， 而利用分子伴侣协助蛋白质复性正成为该领域的新热点。分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象， 并能通过有控制的结合和释放， 促进新生多肽链的折叠、 多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质［4］。最近几年的研究发现， 表面活性剂和环糊精的联合作用也具有促进蛋白质复性的效果， 且表面活性剂和环糊精系统作用机制类似于分子伴侣GroEL［5， 6］， 因此称其为人工分子伴侣复性系统。所以该试验我们探讨了利用人工分子伴侣方法辅助鸡IL-18重组蛋白复性的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料 鸡IL-18成熟蛋白基因重组原核表达质粒（pGEX-mChIL-18）、 E.coli BL21由本实验室构建保存; 二硫苏糖醇（DTT）购自Bioshorp公司; 还原型谷胱甘肽（GSH）、 氧化型谷胱甘肽（GSSG）均购自Roche公司; RPMI1640细胞培养液购自Gibco公司; 透析袋购自Solarbio公司; 刀豆蛋白A（ConA）购自Sigma公司; IPTG购自大连TaKaRa生物工程公司; 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）购自南京旋光科技有限公司; β-环糊精购自成都科龙化工试剂厂; 淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司; SPF青年鸡购自济南赛斯家禽科技有限公司。其余化学试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组鸡白细胞介素18（rChIL-18）融合蛋白的诱导与表达 制备E.coli BL21感受态细胞， 取2 μL阳性表达质粒pGEX-mChIL-18转化感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（Amp， 100 mg/L）LB平板上， 37℃培养过夜（不要超过16 h）。挑取单菌落摇菌提取质粒做PCR和双酶切鉴定， 所用的酶为EcoRⅠ和SalⅠ。然后挑取独立的阳性单菌落， 接入2 mL含Amp的2×YT培养液（Tryptone 16 g/L， Yeast extract 10 g/L， NaCl5 g/L， Amp 100 mg/L， pH7.2）中， 37℃振摇过夜; 次日按1%比例转种于25 mL2×YT培养液中， 继续在37℃摇床上培养至A600=0.6时， 加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L， 进行诱导， 并设GST空载体对照， 继续在37℃振摇培养4 h后， 取部分进行SDS-PAGE分析。
1.2.2 rChIL-18融合蛋白包涵体的分离与溶解 取经SDS-PAGE分析表达量高的诱导菌液20 mL经5000 r/min离心10 min收集菌体， 加入TE2 mL混匀， 冰浴下超声波破碎， 功率450 W， 超声30 s， 间隔30 s， 超声30次。取菌液革兰氏染色镜检是否破碎完全。8000 r/min离心10 min， 取沉淀， 加入含10 g/L Triton-X100的TE2 mL， 充分混匀， 室温放置30 min（该过程中应多次的混匀）。8000 r/min离心10 min， 取沉淀， 加入含10 g/L Triton-X100的TE2 mL， 冰浴下超声波洗涤包涵体， 功率450 W， 超声30 s， 间隔30 s， 超声10次。8000 r/min离心10 min， 取沉淀。
1.2.3 rChIL-18融合蛋白包涵体的变性 向上述沉淀中加入6 mol/L盐酸胍（含有30 mmol/L DTT和0.1 mol/L的Tris-base， pH8.0）至沉淀全部溶解为止， 然后置于37℃、 120 r/min的摇床中反应1 h， 使蛋白彻底变性和还原。
1.2.4 rChIL-18融合蛋白的复性 分别用人工分子伴侣辅助复性法、 盐酸胍-去离子水透析法和盐酸胍-谷胱甘肽复性法对rChIL-18融合蛋白进行复性。（1）人工分子伴侣辅助复性法: 该过程均在37℃、 120 r/min的摇床中进行， 空白复性液为pH8.0、 0.1 mol/L Tris-base含4.78 mmol/L的GSH、 0.478 mmol/L的GSSG及1.195 mmol/L的EDTA。用空白复性液配置含有指定浓度复性助剂的复性液并用于复性。将变性后的蛋白溶液与指定体积的含20 mmol/L CTAB的复性液混合（将蛋白溶液逐滴加入CTAB中）， 在恒温摇床中作用15 min， 然后向其中加入定量空白复性液混匀， 再次在恒温摇床作用15 min后加入适量含15 mmol/Lβ-环糊精的复性溶液使最终溶液中蛋白质浓度、 CTAB浓度、 β-环糊精浓度达到试验所设定的浓度， 继续反应60 min。复性后的蛋白溶液利用透析袋进行透析， 利用去离子水充当透析液， 每4 h换透析液1次， 透析12 h。(2)盐酸胍-去离子水透析法: 将上述利用盐酸胍变性的的蛋白溶液缓慢加至透析袋内， 4℃复性16 h， 经4次去离子水磁力搅拌透析， 每4 h换透析液1次。（3）盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法: 将上述变性的蛋白溶液缓慢滴加至磁力搅拌的复性液中， 至蛋白中浓度为0.1 g/L， 向复性液中加入氧化型和还原型谷胱甘肽， 氧化型终浓度为2 mmol/L， 还原型为1 mmol/L， 4℃复性16 h， 经3次去离子水磁力搅拌透析， 每4 h换透析液1次。对透析后蛋白溶液用Bradford法测纯化蛋白的浓度， 并用淋巴细胞转化试验检测生物学活性。
1.2.5 分析方法 复性后蛋白浓度采用Bradford方法测定， 通过凝胶薄层灰度扫描分析SDS-PAGE结果， 以确定其融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的百分数， 进而确定复性蛋白的回收率， 并测定复性后蛋白的生物学活性。回收率的定义如下［7］: 蛋白回收率=(复性后蛋白的浓度×体积)/(加入变性蛋白的浓度×体积)×100%
1.2.6 rChIL-18融合蛋白生物学活性的测定 采用淋巴细胞增殖试验来测定其活性， 采用MTT法测淋巴细胞的增殖。取健康青年SPF鸡抗凝血5.0 mL， 制备血淋巴细胞悬液， 用0.5 mL细胞培养液RPMI1640（含5 mL/L新生牛血清， 青、 链霉素各100 U/mL）重悬细胞， 调整细胞密度为5×108/L， 取100 μL于96孔板内， 设不同浓度rChIL-18刺激孔， 同时设细胞对照孔、 RPMI1640空白孔、 丝裂原ConA刺激孔和载体GST蛋白刺激孔， 每孔分别设4个重复， 37℃， 50 mL/L CO2培养56 h。每孔加入15 μL浓度5 g/L的MTT， 继续培养4 h， 加入裂解液100 μL， 37℃， 50 mL/L CO2裂解2 h， 于酶标仪上570 nm波长处读取A值。用刺激指数（SI）表示淋转水平。SI=［rChIL-18或GST（+）孔A570平均值－空白孔A570平均值］/(对照孔A570平均值－空白孔A570平均值)。
2 结果
2.1 pGEX-mChIL-18重组质粒的PCR和酶切鉴定 表达质粒pGEX-mChIL-18转化感受态细胞后重新提取质粒的PCR和酶切鉴定（图1、 2）。
2.2 rChIL-18融合蛋白的诱导表达 经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后， rChIL-18在E.coli BL21内得到表达， 经SDS-PAGE电泳分析得到Mr为44000的rChIL-18融合蛋白和26000的GST载体蛋白， 凝胶薄层扫描分析显示rChIL-18的表达量约占菌体总蛋白的32%， 不加IPTG的不表达（图3）。
图1 pGEX-mChIL-18重组质粒的PCR鉴定（略）
Fig 1 PCR Products of pGEX-mChIL-18 recombinant plasmid
M: DL 2000 DNA marker; 1: PCR product.
图2 pGEX-mChIL-18重组质粒酶切鉴定（略）
Fig 2 Construction of pGEX-mChIL-18 recombinant plasmid
M: DL 2000 DNA marker; 1: pGEX-6P-1 plasimid digested by EcoRⅠand SalⅠ; 2: pGEX-mChIL-18 recombinant vector digested by EcoRⅠand SalⅠ.
图3 rChIL-18融合蛋白的诱导表达（略）
Fig 3 The result of expression of rChIL-18
M: Protein marker; 1: Host with pGEX-mChIL-18 induced with IPTG; 2: Host with pGEX induced with IPTG.
2.3 rChIL-18融合蛋白的透析纯化 使用24 mm透析袋将复性后的蛋白溶液进行透析纯化， 纯化后的样品经SDS-PAGE电泳得到了去除杂蛋白的rChIL-18 融合蛋白条带（图4）。
2.4 rChIL-18融合蛋白的复性 根据试验设定利用人工分子伴侣辅助复性的方法的最终复性溶液中盐酸胍、 CTAB、 β-环糊精浓度分别为0.98 mol/L、 2.4 mmol/L、 9.6 mmol/L， 除上述外还含有0.4 mmol/L GSSG、 4.0 mmol/L GSH、 1.0 mmol/L EDTA和0.1 mol/L的Tris-base。包涵体利用6 mol/L盐酸胍变性后， 利用Bradford法测定的rChIL-18的浓度为7.5 g/L。变性蛋白经人工伴侣复性系统辅助复性， 然后利用透析袋透析， 最后再次用Bradford方法测得溶液中rChIL-18融合蛋白浓度为343 mg/L， 而利用盐酸胍-去离子水透析法和盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法所获得的蛋白溶液浓度分别为150 mg/L和7 mg/L。所以利用上述回收率公式得到的有活性的rChIL-18的回收率， 分别为人工分子伴侣复性系统为42.54%、 盐酸胍-去离子水透析法为10.67%、 盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法为14.83%。
图4 rChIL-18融合蛋白的纯化结果（略）
Fig 4 The result of purification of rChIL-18
M: Protein marker; 1: Host with pGEX-mChIL-18 induced with IPTG; 2: Host with pGEX induced with IPTG; 3: Purified protein.
2.5 人工分子伴侣辅助复性的rChIL-18融合蛋白生物学活性的测定 根据文献报道IL-18能够促进淋巴细胞增殖反应。用MTT法检测rChIL-18融合蛋白对外周血中淋巴细胞增殖反应的作用。本试验对rChIL-18融合蛋白设定了100 mg/L～500 mg/L的9个不同浓度水平， 结果显示， 不同浓度的rChIL-18融合蛋白刺激淋巴细胞转化的情况有明显差异， 浓度为150 mg/L时效果最佳， 刺激指数（SI）为4.38; 丝裂原ConA在浓度为7.5 mg/L时也能够明显促进淋巴细胞增殖， SI为4.20， 二者与细胞空白对照相比P&<0.01; 而载体GST蛋白不具有刺激转化作用， 与细胞空白对照相比P&>0.05。
3 讨论
开展对rChIL-18融合蛋白的免疫效应的研究中， 需制备足量具有良好活性的蛋白， 由于真核基因在原核细胞中表达时， 表达产物主要为无活性的包涵体［8］。所谓包涵体是指原核表达的重组蛋白在细菌内凝集， 形成无活性固体颗粒。因为大肠杆菌缺乏真核细胞内促进蛋白折叠的辅助因子及修饰蛋白所需的酶类， 或无法形成正确的次级键导致。所以必须进行变性和复性处理后才能得到具有活性的功能性蛋白。表面活性剂具有与β-环糊精组成人工分子伴侣系统的特性， 而被用于辅助蛋白质复性， 并已在多种蛋白质体系中获得较好的效果［9］。Rozema等［10］采用CTAB和β-环糊精组成的人工分子伴侣对溶菌酶复性进行了试验研究， 发现需要较高浓度CTAB才能很好地辅助溶菌酶复性; 王君等［6］于2005年做了变性溶菌酶复性过程中不同组成的人工分子伴侣系统特性的考察研究， 使我们更全面地了解了构成人工分子伴侣体系的表面活性剂与β-环糊精在辅助蛋白质复性过程中的功能及其作用机制。此外， 董晓燕等［5］做了人工分子伴侣和盐酸胍在促进溶菌酶复性过程中相互协同效应的研究。
包涵体难溶于水， 只溶于变性剂如尿素、 盐酸胍等， 所以我们将表达细菌利用超声波破碎后， 对释放出来的包涵体先经过含10 g/L Triton-X100的TE洗涤后， 再经6 mol/L的盐酸胍溶解变性［11］。在包涵体的复性上， 本试验利用由表面活性剂CTAB与β-环糊精组成的人工分子伴侣复性系统对其进行复性， 首先使CTAB与变性蛋白质形成复合物， 然后加入β-环糊精竞争吸附CTAB， 使CTAB与蛋白质解离并引发蛋白质正确折叠。在利用该方法复性的过程中， 我们还做了盐酸胍-去离子水透析法和盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法。试验结果表明， 人工分子伴侣系统辅助复性的复性率为42.54%。复性产物经淋巴细胞转化试验证明， 利用盐酸-去离子水透析法和盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法获得的产物分别在600 μg/L和400 μg/L时才显示一定的刺激淋巴细胞增殖的生物学活性， 而利用人工分子伴侣复性该蛋白的产物在150 μg/L就出现了很高的刺激指数。所以人工分子伴侣复性系统能够很好地提高rChIL-18的复性率。
本试验对以包涵体形式表达的rChIL-18进行了变性、 复性及生物学活性研究， 获得了具有良好生物学活性的rChIL-18， 为进一步研究其临床免疫效果奠定了基础。
参考文献
［1］ Okamura H， Tsutsui H， Komatsu T， et al. Cloning of a new cytokine that induces INF-γ production by T cells［J］. Nature， 1995， 378(11): 88-91.
［2］ 陈开森. IL-18生物学作用研究进展［J］. 九江学院学报(自然科学版)， 2004， 4(2): 81- 84.
［3］ 胡敬东， 崔治中， 赵宏坤. 鸡IL-18 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达［J］. 畜牧兽医学报， 2005， 36(3): 264-268.
［4］ 张玉秀， 柴团耀. Hsp70分子伴侣系统研究进展［J］. 生物化学与生物物理进展， 1999， 26(6): 554-558.
［5］ 董晓燕 ， 史晋辉， 孙 彦. 人工伴侣和盐酸胍促进溶菌酶复性的协同效应［J］. 化工学报， 2002 ， 53(6): 590-594.
［6］ 王 君， 杨君秋， 刘 铮， 等. 表面活性剂辅助重组蛋白质复性［J］. 化工学报， 2005， 56（7）: 1288-1294.
［7］ 唐彩华， 肖锡宾， 吴 涛， 等. BAC5-scFv的表达、 复性及活性检测［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(1): 67-70.
［8］ Garman SC， Wurzburg BA， Tarchevskaya SS， et al. Structure of the FC fragment of human IgE bound to its high-affinity receptor FcεRIα［J］. Nature， 2000， 406(6793): 259-266.
［9］ Kurganov BI， Tpochieva IN. Artifical chaperone-assisted refolding of proteins［J］. Biochemistry Moscow， 1998， 63(4): 413-419.
［10］ Rozema D， Gellman SH. Artificial chaperone-assisted refolding of denatured-reduced lysozyme: modulation of the competition between renaturation and aggregation［J］. Biochemistry， 1996， 35(49): 15760-15771.
［11］ 萨姆布鲁克J， 拉塞尔DW(黄培堂， 等译). 分子克隆实验指南［M］. 3版. 北京: 科学出版社， 2002: 1256-1260.